Обратный колосок: Плетение косы «Обратный колосок» • EstPortal

Французская коса наоборот — как плести самой, пошаговые фото

В прошлой статье был описан мастер-класс как плести обычный колосок, а в этой научимся плести необычный колосок, под названием французская коса наоборот. Такая коса имеет особый вид и подойдет для любого события, будь то простая вечерняя прогулка, выход на работу или на праздник.
Как и любая другая коса она может быть свободной, пышной, немного специально «небрежной» или тугой и тонкой. Но последний вариант больше подойдет для девочек.

Французская коса наоборот — плетем сами себе

Плетение французской обратной косы отличается от обычной только в том, что пряди волос плетутся не наружу, а внутрь. Для того чтобы понять как плести самой, рассмотрим пошаговые фото с описанием данного процесса:

1. Как и для любой другой прически, предварительно волосы следует расчесать и отделить в верхней части головы пучок волос

2. Теперь этот пучок разделим на три части, равные между собой. На ваше усмотрение, можете брать мелкие пряди или крупные, в зависимости от этого и коса будет выглядеть немого по разному.

3. Начнем плетение с лева. Возьмем первую прядь и покладем ее ПОД вторую и третью пряди.

4. Аналогично делаем и с третьей прядью. Ложем ее СНИЗУ, между второй и первой прядью.

5. Дальше проделываем все тоже самое, что в шаге 1 и 2, но в дополнение прибавляем пряди волос , взятые с висков головы. Дополнительные пряди прибавляем к основной центральной (Все вместе кладем под низ).

6. Сохраняем данный принцип плетения до конца и в завершении заплетаем обычную косу наоборот ( то есть, по низ). И закрепляем ее резинкой.

7. Французская коса наоборот готова, теперь немного украсим ее. Для этого потянем за наши колосочки в косе, с низу в верх. Это придаст видимость более толстой и объемной косы. Вытягивать волосы из колосочков можно произвольно, смотря насколько свободную и пышную косу хотите получить.

Вот собственно и вся хитрость плетения косичек. Когда ее знаешь, коса наоборот уже не кажется чем-то сверхъестественным (утрирую :)). И можно даже поэкспериментировать с плетением в разных направлениях головы, количеством таких кос и украшением их аксессуарами для волос.

( 1 оценка, среднее 5 из 5 )

Обратный колосок

Среди большого количества видов кос и косичек, самыми популярными считаются косы колосок. Для исполнения их используются разные техники плетения.

Колосок очень оригинальный вид плетения, который подходит и на среднюю длину волос, и на длинные волосы, но более популярным считается плетение обратного колоска. Оно выглядит эффектней и интересней. Их можно использовать как для причесок на каждый день колосков, так и для вечерней, а при помощи разных дизайнерских штучек – это может быть прическа и на вечеринку, и на свадьбу, и на юбилей.

Как плести обратный колосок

Вариантов плетения есть много: можно на бок, можно ровно, можно вокруг головы, но схема плетения одна. Она достаточно легкая в исполнении и плести обратный колосок можно самому. Для этого понадобится только расческа тоненькая и резинка или заколка для закрепления косы.

Предварительно рекомендуется тщательно расчесать волосы, чтобы не путались при плетении. А теперь приступаем к выполнению колосков с обратной техникой выполнения:

  1. Зрительно обозначьте себе прямую линию, по которой Вы будете плести.
  2. У виска посредине отделяем 1 широкую прядь волос – это будет начало нашего колоска.
  3. Выделенную прядь разделяем на равные 3 части.
  4. Берем прядь слева, кладем ее под центральную (центральная становится слева).
  5. Прядь справа кладем тоже под центральную, ту которая была слева.
  6. Берем слева прядь и подбираем волосы с боков, в виде прядей, и закладываем под центральную, те же действия делаем и с другой стороны.
  7. Все делаем сначала, пока не закончатся волосы по бокам. Потом просто либо завязываем резинкой, либо продолжаем плести также под низ только 3 пряди.

Колосок в обратную сторону может быть длиннее хвостика, может быть короче – это все уже зависит от предпочтений. Для украшения можно использовать и шпильки, и цветочки, и камушки, и разные заколки – все выбирается по ситуации и желанию.

Внешний вид колоска и размер прядей

  • можно плести мелкими прядями, подбирая немного волос по бокам, колосок будет выглядеть аккуратным и насыщенным;
  • можно заплести широкими прядями, подбирая много волос, тогда коса будет объемной и эффектной;
  • можно плести, используя и большие и маленькие пряди, выкладывая, как бы рисунок, тогда будет очень интересный результат;
  • можно плести, затягивая, а можно легко.

Но выбор всегда остается за Вами. Если научиться плести самим и иметь желания к экспериментам, то можно и придумать какой – то свой вариант.

На видео можно подробнее посмотреть, как заплести обратный колосок. Учитесь разным плетениям и фантазируйте, ведь благодаря экспериментам – появляются новые виды плетения, новые прически, новые комбинации.

Уже существует большое количество причесок на основе колосков. Обратный колок, как вид плетения открыли не так давно, но уже пользуется большим спросом.

Видео как плести обратный колосок или “рыбий хвост”

Косы — Академия Профессий

Косы всегда в моде.

Коса – это, пожалуй, самый простой и распространенным вид прически. Заплетенные разными способами, они смогут прекрасно дополнить как повседневный, так и самый изысканный вечерний образ.  Благодаря разнообразным видам и способам плетения, косы пользуются огромной популярностью. Это одна из самых женственных причесок. Аккуратно заплетенные волосы-  удобная прическа в повседневной жизни, актуальная в офисной обстановке и красивая на торжестве. Однако плетение кос не такая уж и простая задача, чтобы научиться красиво заплетать волосы, придется запастись терпением и выдержкой. Зато освоив одну или несколько техник создания подобных причесок, вы сможете выглядеть привлекательно в любое время и по любому случаю. Этим летом косы будут одной из самых популярных причесок.  Модные косы- это не только множество идей для волос разной длины, но еще и достаточно простые в сооружении конструкции. Чтобы волосы становились послушными и легко поддавались плетению и укладке, можно использовать различные средства в виде пены, геля или закрепить неровные пряди заколками. Также нужна хорошая расчёска.

 

Обычная коса. 

Самым распространенным  и знакомым с детства видом кос стала обычная косичка, плетенная из трех прядей волос. Разделив волосы на три части и соблюдая последовательность, переплетаем волосы, между собой. Такую косу можно отнести к экспресс прическам. Она не требует много времени, что позволяет использовать их ежедневно. А самое главное они выглядят модно и стильно, придавая образу привлекательность.

Плетение двух кос.

 На густых тяжелых волосах здорово и оригинально будут смотреться две косы. Для такой прически волосы необходимо разделить на две равные части. Теперь каждую из них необходимо заплести обычным способом, только важно проконтролировать, чтобы плетение обеих кос начиналось с одинакового уровня.

 

 

Коса жгут.

Коса жгут отличная альтернативой привычным косам. Главное ее преимущество – простота плетения, с ним без проблем справиться даже ребенок. Жгут лучше всего делать на «конском» хвосте, при желании его можно сделать и без предварительного завязывания волос, в этом случае образ выйдет не таким строгим.

 

 

Коса корона.

Прическа корона – это коса, оплетенная вокруг головы, пришедшая к нам со времен средневековья. Именно тогда появилось большое количество разнообразных плетений. Одной из них была корона, которую украшали растениями, бусинами, ленточками и т.д. В настоящее время укладка – признак элегантности, благородства и женственности. Заплетать косу вокруг головы очень модно, и многие девушки уже взяли это на вооружение. Чтобы прическа стала украшать вашу голову, необходимо иметь длинные волосы и истинную женственность. Прическа невероятно актуальна. Ее можно использовать для создания романтичного образа для свидания.

Объемная французская коса .

В последнее время французская коса стала одним из самых популярных разновидностей кос. Очень красивая объемная коса может получиться, если французскую косу заплести не классическим способом, а наоборот. Ее можно заплетатьпо центру, по периметру, по диагонали, по бокам и т.д.

 

Плетение косы Колосок.

Заплести косичку «колосок» будет немного сложнее обычной, но техника плетения очень похожа, поэтому Вы справитесь. Начинать плетение следует также как у обычной косы, только необходимо брать не все волосы, а лишь верхнюю часть и разделить их на три равные пряди. Важно ровно распределить пряди, чтобы в итоге коса выглядела ровной. Пряди начинаем плести, как обычную косу и потихоньку вплетаем новые небольшие пряди волос с боку из оставшихся волос. таким образом продолжайте вплетать пряди в основную косу, пока не закончится линия роста волос на голове.

 

Обратный колосок.

Все, кого хоть раз интересовало плетение косичек на средние и длинные волосы знают, что обычный колосок имеет V- образную форму. А наш необычный колосок будет развернут в обратную комнату, чем обязательно привлечет к себе внимание.

 

 

Коса рыбий хвост.

Коса «рыбий хвост» – один из лучших вариантов повседневной причёски. Основное отличие такой косички в том, что она заплетается из четырёх прядок (в отличие от обычной косы, формирующейся из трёх прядей).  Узор в косичке «рыбий хвост» очень похож на колосок, он тоненький и мелкий. Очень часто у новичков не получается с первого раза заплести такую косичку, ведь для такой работы требуется определённая сноровка, терпение и навыки. Также в процессе плетения могут понадобиться вспомогательные элементы, а именно: расчёска, невидимки, заколки или резинки для волос.

Французский водопад.

Любительницам нежных романтических образов прекрасно подойдет прическа «французский водопад». Она позволит без труда создать легкую, объемную укладку. Наиболее выигрышно такая прическа выглядит на завитых локонах, но и на прямых волосах она будет смотреться тоже неплохо, особенно если они мелированные. Данное плетение может опоясывать голову, создавая из волос подобие венка, спускаться по косой вниз или образовывать двойной ряд кос, что смотрится особо эффектно. Плетется «Французский водопад» по принципу колоска, но при этом с одной стороны все время выпускаются отдельные прядки.

 

 

Плетение обратного колоска (рыбий хвост)

1Отделяем часть волос на макушке и делим ее на три пряди. Первое проплетение (по одному стежку с каждой стороны) делаем из трех прядей, как будто начинаем заплетать обратную французскую косу – сначала справа крайнюю прядь подкладываем под среднюю, затем крайнюю слева подкладываем снизу под среднюю. Затем две из трех прядей соединяем в одну и далее в плетении будем считать, что у нас всего две основные пряди – первая (которая слева) и вторая (которая справа).

2Начнем плетение с левой стороны. Берем первую прядь в левую руку так, чтобы рука располагалась ладонью вниз. Указательным пальцем отщипываем маленькую прядь от первой основной пряди и переворачиваем руку против часовой стрелки так, чтобы маленькая прядь оказалась в середине (между основными двумя прядями). Затем подхватываем эту маленькую прядь и присоединяем ко второй основной пряди, а левой рукой подныриваем под первую прядь, отделяем часть волос от виска, проносим ее под первой прядью и так же присоединяем ко второй. Так мы сделали подхват.

3Дальше мы повторяем второй шаг то с правой стороны, то с левой до самого конца плетения. Итак, теперь справа: указательным пальцем отделяем маленькую прядь, переворачиваем руку на 180 градусов и присоединяем тоненькую прядь к первой большой пряди. Правой рукой подныриваем под вторую основную прядь и делаем подхват: отделяем часть волос от правого виска, добавляем ее к первой основной пряди косы.

4В такой же технике продолжаем плетение косы из двух прядей, колоска или рыбьего хвостика. Вот такой рисунок у вас должен получиться. Плетение не столько сложное, сколько долгое в своем исполнении, поскольку пряди отделяем очень мелкие и их много.5. Когда волосы для подхвата закончились, продолжаем плетение без добавления дополнительных прядей.

5Когда волосы для подхвата закончились, продолжаем плетение без добавления дополнительных прядей.

6Очень красивое плетение, очень здорово выглядит на любых волосах. Можно повытягивать крайние пряди косички, тем самым увеличить ее вдвое и даже втрое, но это уже на ваше усмотрение. Желаю Вам успешного обучения и отличных результатов!

Как заплести колосок самой себе: пошаговый урок быстрой прически

Колосок, или французская коса, может выглядеть сложной укладкой, но это не так. Сделать стильную прическу можно за считанные минуты. Главное – практика и немножко терпения. Следуй этим простым шагам для того, чтобы заплести колосок самой себе.

Колосок, она же французская коса, – одна из самых стильных причесок всех времен и народов, которая всегда в тренде. Эта универсальная прическа имеет массу вариантов плетений – от обратного в стиле Лары Крофт и затылка в духе учениц частных школ до венка вокруг головы или корзинки на затылке а-ля 40-х годов.

Среди звезд самым популярным вариантом быстрой прически является колосок на бок, который выглядит очень стильно на волосах средней длины и очень длинных локонах. Все вариации прически французская коса ты можешь заплести самостоятельно, если научишься плести классический колосок – обычную косу от линии роста волос. 

Что понадобится для колоска: маленькая резинка (желательно силиконовая) для волос, тонкий гребень, расческа-щетка и немного свободного времени.

Как заплести колосок самой себе: пошаговые инструкции

Способ 1: классический колосок

  • Перед плетением хорошо расчеши волосы щеткой, чтобы разгладить любые узелки.
  • Собери волосы в верхней части головы.
  • Начиная у линии роста волос вокруг лица, раздели пряди на три равные части. Держи правую секцию в правой руке, левую – в левой руке и среднюю прядь – между большим пальцем и другим пальцем любой из рук.
  • Чтобы начать плетение, перекрести правую секцию над средней частью, затем повтори этот ход с левой стороны, затягивая волосы вниз в процессе плетения. Подтяни секции, чтобы они довольно плотно пересекались между собой. Потом, при желании, можешь ослабить плетение, чтобы придать косе более объемный и небрежный стиль.
  • Прежде чем повторять перекрестное движение с правой секцией, собери немного волос с правой стороны головы и добавь их в эту прядь; теперь нужно переплести эту большую часть волос со средней частью косы.

Совет: убедись, что участки волос, которые ты добавляешь в процессе плетения, примерно равны между собой, иначе коса будет выглядеть однобокой.

  • Добавь волосы в левую секцию колоска, собрав небольшой участок (равный размеру того, который вы только что собрали с другой стороны) оставшихся волос с левой стороны головы, и перекрести его над средней частью.
  • Продолжай такое плетение до затылка, потом начни перекрещивать волосы, как в обычной косе.
  • Закрепи косу маленькой силиконовой резинкой. Чтобы добавить плетению объема, придерживай кончик колоска и аккуратно вытягивай секции.

Если хочешь освоить обратное плетение косы, делай всё то же самое, что описано выше, только перекрещивай пряди не над средней секцией, а под ней. Это принцип плетения модных боксерских кос наизнанку.

Способ 2: колосок на чёлке

Еще одно красивое плетение колоска на случай, если тебе хочется добавить прическе красивый акцент в виде плетения, но при этом, чтобы сами волосы остались распущенными. Просто добавь элемент косы лишь на челке и образ сразу заиграет новыми красками. Для этого повтори следующие действия:

  • Тщательно расчеши пряди, чтобы избежать колтунов. Отдели только чёлку или небольшую прядку волос у лба.
  • Начинай плетение по классической схеме, описанной выше, двигаясь от одного уха к другому.
  • Когда дойдешь до конца, закрепи кончик колоска под волосами с помощью прозрачной силиконовой резинки либо невидимок, чтобы его не было видно.
  • Остальную копну волос можно немного подкрутить, чтобы придать образу более расслабленный вид, или же оставить локоны распущенными. Зафиксируй прическу лаком.

Вуаля – ты обладательница простой, но в то же время оригинальной прически на каждый день. Плетение можно сделать по классическому принципу или же наоборот, чтобы коса получилась более объемной.

Способ 3: коса вокруг головы

Косичка-ободок – еще одна классная альтернатива обычному колоску. Она выглядит как своего рода аксессуар – объемный «венок» из волос, красиво украшающий образ. Это одна из самых роскошных и нестандартных причесок, с которой просто нельзя остаться незамеченной.

Она может быть тонкой или объемной, одинарной либо двойной, строгой или же небрежной.  

Чтобы узнать, как заплести колосок по окружности головы, придерживайся следующей инструкции:

  • Подготовь волосы, хорошенько их расчесав и разделив на три одинаковые пряди.
  • Затем начинай плести ободок по типу знакомого колоска навыворот, захватывая прядки по очереди то справа, то слева, перекрещивая их под центральной прядью, а не над ней, то есть вплетая пряди в косу снизу.
  • Двигайся в таком темпе до уха справа, а дальше идет плетение обычной косы.
  • Уложи получившуюся косу по окружности головы и закрепи её с помощью невидимок.
  • Зафиксируй прическу лаком и при желании задекорируй трендовыми заколочками.

Совет: если ты хочешь получить строгую косу, бери для плетения тонкие прядки, а для романтического варианта отделяй широкие пышные пряди.

Способ 4: плетение рыбий хвост

Очень эффектный и стильный вариант плетения – рыбий хвост – подойдет как для повседневного ношения, так и в качестве торжественного варианта. А разобраться, как плести косички по типу рыбьего хвоста, поможет инструкция ниже:

  • Расчеши волосы и обработай их водой, муссом или спреем, чтобы пряди не пушились и не электризовались.
  • Зачеши всю копну волос назад и отдели по одной прядке (не более 2,5 см) в области обеих висков.
  • Отобранные пряди в височной зоне перекрести между собой на затылке, заводя правую сверху над левой.
  • Скрещенные прядочки оставь в одной руке, а тем временем другой отдели следующую прядь, такого же размера. Новую левую прядку перекрести с предыдущей правой таким образом, чтобы она оказалась над ней, и прижми всю конструкцию рукой к голове.
  • Свободной рукой выбери новую прядь с противоположной стороны и перекрести её сверху с уже плетеной прядью.
  • Продолжи заплетать косичку по такой же схеме, вплетая новые прядки с противоположных сторон до окончания «рыбьего хвоста».
  • Зафиксируй результат заколкой или резинкой и сбрызни лаком.

Как видишь, плетение по принципу рыбьего хвоста также имеет множество вариаций исполнения, например, рыбий хвост на бок, в хвосте или даже вокруг головы.

Способ 5: широкая коса из четырех-пяти и больше прядей

Когда ты научишься заплетать стандартный колосок и французскую косу наизнанку, освоить вариант плетения из четырез-пяти одинаковых прядей, как в макраме, уже не составит труда. Это эффектная укладка подойдет для различных мероприятий и праздничных образов. Чтобы заплести косу из 5 прядей, повтори следующие шаги:

  • Расчеши волосы и раздели их на пять равных частей таким образом, чтобы центральная прядь не была разделена пробором.
  • Собери каждую прядь в хвостик.
  • Затем заплети каждую секцию по принципу обратной французской косы, начиная плетение не от чёлки, а ближе к макушке.
  • Каждую готовую косу закрепи с помощью маленькой резинки, предварительно растянув прядки.
  • При желании, можно завернуть все кончики в колечко и закрепить их внизу затылка, чтобы их не было видно под полотном косы.
  • Зафиксируй прическу лаком и укрась трендовыми заколками.

Как плести прическу колосок. Фото инструкция

Прическа колосок подразумевает плетение косы, начиная где-то от макушки, прихватывая пряди волос по бокам.

Фото

Кому подходит прическа колосок?


Данная прическа очень практична и разнообразна. Носить колосок можно каждый день, а внося в простое плетение некоторые изменения и аксессуары, можно сделать отличную прическу на вечер.


Колосок плетется как на средних, так и на длинных волосах любой структуры, делая свою обладательницу неподражаемой дамой с настоящей русской косой.


Классический колосок или русская коса


Данная прическа станет отличным вариантом на каждый день, ведь волосы убраны и не мешают заниматься нужными делами. Особенно хорош этот прочный вариант прически для маленьких девочек, ведь многие укладки растрепываются в течении школьного дня, а колосок отлично сохранит форму.


Как заплести колосок?


  1. Расчесать волосы и разделить прядь на макушке на три части, как на фото.
  2. Плести обычную косу, только прихватывая сбоку волосы, как показано на инструкции.
  3. Когда плетение дойдет до затылка и прихватывать будет нечего, просто плести косичку до конца и закрепить.


 


Как сделать прическу колосок видео?


На данном видео можно подробно разобрать, как заплести колосок своими руками:


Так же можно заплести колосок из косы рыбий хвост, что так же подробно описано в этом видео:


Обратный или вывернутый колосок


Обратный колосок подразумевает плести все по той же схеме, только вот пряди кладутся не одна на одну, а наоборот, каждую прядь нужно подкладывать под другую.


Как заплести обратный колосок?


  1. Расчесать волосы, и выбрать прядь на макушке.
  2. Разделить эту прядь на три части, как на фото 1.
  3. Перемещаем прядь № 1 под прядь № 2, а прядь № 3 кладем под прядь № 1.
  4. Повторять все то же самое, только подхватывая боковые пряди из основной массы волос.
  5. Плести до конца и закрепить кончик резинкой.


По завершению плетения можно немного распустить получившуюся косичку, потихоньку вытягивая прядки. Так коса выйдет очень объемная.


Видео: как заплести обратный (вывернутый) колосок?


На данном видео подробно описано, как заплести вывернутый колосок самой себе:


Прическа змейка, мастер — класс с фото, пошагово

Среди большого разнообразия косичек и колосков, сегодня наиболее популярной считается французское плетение наоборот. Его еще называют обратным, или выпуклым колоском. Он делается очень быстро и смотрится достаточно эффектно. Каждая девушка после небольшой тренировки сможет самостоятельно заплести обратный колосок, даже самой себе.

Обладательницам длинных густых волос обратный колосок особенно нравится. Его плетут посередине головы сверху вниз, по диагонали и даже по кругу вдоль овала лица. Модницы вплетают в него ленты и бусы, делают воздушные пряди и украшают цветами. Предлагаю вашему вниманию одну из необычных вариаций для объемного колоска. Я назвала его «змейка», так как косичка будет извиваться наподобие этого животного. Приготовлю расческу, гребешок и резинку. Больше ничего не потребует. Начинаю работу с подготовки волос:

1. Расчесываю локоны широкой щеткой, чтобы волосы не запутывались при плетении. Рекомендуют нанести на шевелюру небольшое количество мусса или взбрызнуть лаком для волос. Такая обработка утяжелит пряди и сделает их послушней.

2. С помощью тонкого гребешка я отделяю часть волос вдоль линии лба, начиная от левого виска. Это должна быть средняя полоска волос, из которой можно будет сформировать колосок. Расчесываю ее гребешком, а остальные волосы скрепляю крокодильчиком.

3. Беру тонкую прядь волос от левого виска. Ее следует разделить на три равные части. Колосок можно формировать из крупных прядей, но можно взять локоны поменьше. Все зависит от того, что вы хотите получить в итоге. Я предпочитаю формировать ровное, симметричное плетение их мелких локонов. Плетение обратной косички лучше начинать слева. Первая прядь заводится под низ двух остальных, то есть проходит под второй и третьей прядью. Такие же действия выполняются с третьим локоном, заводя его под второй и первый. Вот как получается обратное плетение.

4. Чтобы сформировался французский колосок, в каждое звено косички вплетаются дополнительные прядки, которые нужно брать сверху и снизу. Обратный колосок приобретет объем, если аккуратно вытягивать пряди из него. Я не доплетаю косичку до правого виска, а оставляю небольшую часть волос в этой области нетронутой. Это делается, чтобы выполнить поворот колоска в другую сторону. Сначала я плела косу слева направо, теперь нужно повернуть справа налево. Чтобы повернуть косу вниз, я перестаю вплетать локоны слева от колоска, но продолжаю брать пряди от линии виска.

5. Чтобы повернуть плетение влево, я перестаю захватывать локоны снизу, но продолжаю вплетать свободно свисающие над косой пряди. Так я продолжаю плести колосок, пока не дойду до левого края головы. Но не до самого конца, нужно оставить немного волос слева, чтобы выполнить поворот косички вниз и направо.

6. Аналогично тому, как я делала первый поворот, я выполняю второй. Перестаю вплетать пряди справа и продолжаю использовать волосы слева – коса повернула вниз. Использую только верхние локоны – коса поворачивает направо.

7. Не забываю периодически останавливаться и вытягивать прядки из косы, чтобы сделать ее более округлой и, так сказать, ажурной. Третий поворот я выполняю аналогично первым двум и доплетаю колосок до левого края волос. Длина волос не позволяет сделать больше поворотов «змейки», поэтому на данном этапе плетение заканчивается.

8. Фиксирую край косы обычной резинкой. Остальные волосы можно оставить распущенными, но я решила скрепить их вместе с косой в один очаровательный хвостик. Теперь можно аккуратно расправить пряди, вплетенные в косу, и те которые свисают между ее ярусами. Возможно, где-то локоны получились длиннее, где-то короче. Второй вариант нужно немного удлинить, чтобы прическа была ровной.

9. Укладка кажется незаконченной без какого-либо украшения. Я решила использовать маленький черный бантик, который подойдет для повседневного образа.

обратная ориентация зародыша 1 мутанты дают три цветочка на один колоск

обратную ориентацию зародыша 1 мутанты дают три цветочка на колосок
БЕРКЛИ,
КАЛИФОРНИЯ

Калифорнийский университет

обратная ориентация зародышей 1 мутантов дают три цветочка на
колоск


— Каплинский Н.К., Фрилинг, М

Обратная ориентация зародыша 1 — R (rgo1 -R) — это ранее описанный
мутант, у которого эмбрион обращен к основанию уха, обратное нормальному
ориентация ядра (Sachan and Sarkar, MNL 52: 119-120, 1978).Подобный рецессивный
фенотипы были объяснены обращением нормального развития; в
нижний цветочек колоска развивается в отличие от верхнего цветочка (см.
в Джексоне, MNL 70:66, 1996). Похоже, что фенотип обратного зародыша
фактически происходит из-за развития одного лишнего цветочка на колосе (чел.
комм. Г. Чак и Р. Керстеттер). В кисточке три цветочка и девять
пыльники часто, но не всегда встречаются у растений rgo1 (рис.
1).Уши мутантов имеют по три цветочка на колосок, в отличие от
два у дикого типа (рис.
2). Это говорит о том, что rgo1 может участвовать в регулировании
переход меристем колосков в меристемы цветков.

Рисунок
1. rgo1 метелка-колосок, показывающая развитие трех цветков,
на каждом колоске получается девять пыльников.

Рисунок
2. СЭМ проявляющего уха рго1 . На левой панели показано ухо. На верхней правой панели показаны три меристемы цветков, развивающихся на одном колоске.
На нижней правой панели показан развивающийся третий цветочек с пыльником.
зачатки перевернуты относительно их нормальной ориентации.


Обратите внимание на : Комментарии, представленные в Координационный центр по генетике кукурузы
Информационный бюллетень можно цитировать только с согласия авторов.

Вернуться к онлайн-индексу MNL 72

Вернуться к индексу информационных бюллетеней кукурузы

Вернуться на домашнюю страницу MaizeGDB

Шестирядный колос 4 (Vrs4) контролирует детерминированность колосков и рядность ячменя

Abstract

Архитектура соцветий ячменя ( Hordeum vulgare L.) обычен среди видов Triticeae, которые несут от одного до трех одноцветковых колосков на каждом междоузлиях позвоночника. Тройная меристема колосков — одна из уникальных особенностей колосков ячменя, у которых на каждом междоузлиях позвоночника образуются три колоска (один центральный и два боковых). Плодовитость боковых колосков на тройной колосковой меристеме придает рядовость колосам ячменя. Шестирядные колосья демонстрируют плодородные боковые колоски и дают повышенный урожай зерна на колос по сравнению с двухрядными колосьями со стерильными боковыми колосками.Таким образом, к настоящему времени у ячменя были выделены два локуса, управляющих рядовым фенотипом, которые включают шестирядный колос1 ( Vrs1 ) и Intermedium-C . В настоящем исследовании мы выделили шестирядный колос 4 ( Vrs4 ), ортолог ячменя кукурузы ( Zea mays L.), ген архитектуры соцветия RAMOSA2 ( RA2 ). Восемнадцать кодирующих мутаций ячменя RA2 ( HvRA2 ) были специфически связаны с латеральной фертильностью колосков и потерей детерминированности колосков.Анализ экспрессии с помощью гибридизации мРНК in situ и микроматрицы показал, что Vrs4 ( HvRA2 ) контролирует рядовой путь через Vrs1 ( HvHox1 ), негативный регулятор фертильности латеральных колосков ячменя. Более того, Vrs4 может также регулировать транскрипты ячменя SISTER OF RAMOSA3 ( HvSRA ), предполагаемой трегалозо-6-фосфатфосфатазы, участвующей в гомеостазе трегалозо-6-фосфата, участвующем в контроле детерминированности колосков.Наши данные по экспрессии показали, что, хотя RA2 сохраняется среди различных видов трав, его гены-мишени, расположенные ниже по течению, по-видимому, модифицированы у ячменя и, возможно, других видов трибы Triticeae.

Архитектура соцветий очень разнообразна среди представителей семейства злаковых (Poaceae), в которых колоски представляют собой основные строительные блоки, состоящие из одного или нескольких цветков, окруженных двумя чешуйками. Экономически важные виды трав трибы Triticeae, такие как пшеница ( Triticum spp .), ячмень, тритикале (× Triticosecale Wittm. ex A. Camus) и рожь ( Secale cereale L.), как правило, обладают безветвистым колосовидным соцветием, тогда как соцветия тропических видов, например кукурузы, Sorghum Виды и рис ( Oryza sativa L.) имеют сильно разветвленные кисточки или метелки. Ветвление соцветий кукурузы, по-видимому, в значительной степени регулируется генной сетью RAMOSA , которая включает гены RAMOSA1 ( RA1 ), RA2 , RA3 и RAMOSA1 ENHANCER LOCUS2 ( REL2 ) ( 1).У кукурузы детерминированность меристем пары колосков (SPM) опосредуется через RA2 , который кодирует транскрипционный регулятор, содержащий домен боковых границ органов (LOB), который функционирует выше комплекса, обеспечивающего детерминированность RA1 и REL2 (2-4 ). Экспрессия RA1 зависит от RA3 , которая кодирует фосфатазу, участвующую в метаболизме трегалозы (5). Ортологи RA1 и RA3 уникальны для травяного трибы Andropogoneae (парные колоски возникают из SPM), но близкие паралоги RA3 с пока неизвестной функцией существуют в ячмене ( HvSRA ) и других. травы (5).

Соцветие ячменя представляет собой неопределенный колос, на котором образуются три одноцветковых колоска на каждом междоузлиях позвоночника, которые переходят в один центральный и два боковых колоска (рис. 1 A ) (6, 7). В зависимости от размера боковых колосков / цветков и плодовитости ячмень подразделяется на два различных типа рядков; т. е. двурядный и шестирядный ячмень (8). У двурядного ячменя центральный колоск плодороден и дает зерно, а два боковых колоска остаются бесплодными (рис.1 G ). У шестирядного ячменя все три колоска плодовиты и развиваются в зерна (рис. 1 B ). Шестирядный фенотип контролируется по крайней мере пятью независимыми локусами, которые включают Шестирядный колос1 ( vrs1 ), vrs2 , vrs3 , vrs4 и Intermedium-C ( Int-c ) . Vrs1 кодирует фактор транскрипции класса I гомеодомен-лейциновую застежку-молнию, который является негативным регулятором фертильности латеральных колосков (9).Мутант vrs1.a способствует фертильности боковых колосков, что приводит к образованию полного шестирядного колоса (рис. 1 B ). Аллели в локусе int-c , который является ортологом гена одомашнивания кукурузы TEOSINTE BRANCHED1 ( HvTB1 ) (10), изменяют латеральное развитие колосков относительно аллельной конституции vrs1 (рис. 1 ). F ). Потеря функции vrs1.a обычно сопровождается Int-c.a у шестирядного ячменя и функциональным Vrs1.b x int-c. b в двурядном ячмене. Остальные vrs локусов vrs2 , vrs3 и vrs4 демонстрируют различные уровни фертильности латеральных колосков с полной фертильностью латеральных колосков, наблюдаемые у мутантов vrs4 (Рис. 1 C E ). Помимо латеральной фертильности колосков, мутанты vrs4 и обнаруживают неопределенные тройные меристемы колосков (TSM), тем самым производя дополнительные колоски / соцветия. Очевидная неопределенность TSM у мутантов vrs4 предполагает, что vrs4 участвует в генетическом пути, который регулирует высококонсервативную детерминированную природу TSM, присущую видам Hordeum .

Рис. 1.

Морфология спайков различных локусов рядового типа и фенотип vrs4 . ( A ) Двухрядный колос ( Vrs1 ): плодородные центральные колоски (CS) и стерильные боковые колоски (LS). ( B ) Шестирядный шип1 ( vrs1 ): полностью плодородные CS и LS. ( C ) Шестирядный колос2 ( vrs2 ): плодовитость LS наблюдается у основания колоса с редкими дополнительными колосками [дополнительный колосок (AS) плодородный или стерильный, AS — светло-зеленого цвета]; вдоль колоса LS иногда увеличиваются и устанавливаются семена, ( D ) Шестирядный колос3 ( vrs3 ): основание колоса выглядит двухрядным, а оставшаяся часть — шестирядной.( E ) Шестирядный шип4 ( vrs4 ): шип, аналогичный vrs1 , с частой опорой AS (светло-зеленого цвета). ( F ) Intermedium-C ( int-c ): LS — увеличенные, установленные семя, которые обычно меньше, чем у vrs1 , LS без ости. ( G ) Двухрядный колос дикого типа (Пиролайн). vrs4 мутантные шипы: ( H ) vrs4.l , ( I ) BW-NIL ( mul1.a ).( J ) BW-NIL ( vrs4.k ): шестирядный вид и образование AS и дополнительных соцветий (AF). ( K ) Тройка колосков на одном междоузлиях позвоночника. ( L и M ) BW-NIL ( vrs4.k ) ( L ) и vrs4.l ( M ) с указанием AS и AF; исходная тройка: CS, LS с леммой (L) и palea (P). AF развился на рахилле LS. ( N ) Формирование семян с участием АС и АФ. ( O ) Классы подмышечных структур, продуцируемых мутантом vrs4 vrs4.l и шипы Piroline дикого типа. Показано общее количество плодородных или стерильных пазушных структур у растений, выращенных осенью. Данные были записаны для пяти растений, в среднем по два колоса на растение. (см. набор данных SI S1 A для SE и значимости теста t ).

В настоящем исследовании мы выделили локус vrs4 с помощью генетического картирования и обширного анализа мутантов. Наши данные показали, что Vrs4 лежит в основе HvRA2 , ортолога фактора транскрипции кукурузы RAMOSA2 , который важен для развития соцветий у трав.Тканевая локализация посредством гибридизации мРНК in situ в незрелых колосках показала, что HvRA2 экспрессируется очень рано во время развития соцветия и, скорее всего, ограничивает меристему TSM ячменя тремя колосками. Анализ экспрессии генов в сочетании с экспериментами с микрочипами продемонстрировал, что HvRA2 , вероятно, может функционировать двумя разными путями, тем самым устанавливая спайковую архитектуру посредством регуляции детерминированности TSM и контролируя путь рядового типа, специфичный для Hordeum .

Результаты

vrs4 Мутанты отображают неопределенный TSM и шестирядный фенотип.

В отличие от кукурузы или сорго, у которых колоски развиваются из SPM, незрелые колосья ячменя развивают TSM, который возникает из первой подмышечной меристемы сразу после стадии двойного гребня (первая репродуктивная стадия). TSM детерминированы и образуют три отдельных холмика, образующих три вторичные подмышечные меристемы (AM), одну центральную меристему колосков (CSM) и две боковые меристемы колосков (LSM) (рис.2 A и SI Приложение , рис. S1 A ). Каждая меристема колосков сначала дифференцируется на пару зачатков чешуек (Fig. 2 A ), а затем в одну меристему цветков (FM). Анализ с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) дикого типа и мутантов vrs4 на стадии двойного гребня не выявил никаких морфологических различий, что позволяет предположить, что нет изменений в детерминированности AM, приводящей к образованию зачатков с тройными колосками (рис. 2 A и ). B ).Появление двух дополнительных насыпей по обе стороны от LSM было первым видимым отклонением, наблюдаемым в мутантных соцветиях vrs4 (Рис. 2 B ). Дополнительные колоски / соцветия, появляющиеся на междоузлиях позвоночника ( SI Приложение , рис. S1 B и C ), часто были плодородными и развивались в зерна (рис. 1 L и N ). Дополнительные колоски имели ту же ориентацию (зачатки леммы на абаксиальной стороне), что и нормальные колоски (рис.1 M и SI Приложение , рис. S1 A , B , D и E ). Однако дополнительные соцветия были ориентированы противоположно нормальному колоску (примордия леммы на адаксиальной стороне, показывающая альтернативную ориентацию образования цветков на рахилле) и не имели чешуек (Рис. 1 M ). Помимо дополнительных колосков / цветков (Рис.1 O и SI Приложение , Рис. S1 G ), мы редко встречали дополнительные пестики ( SI Приложение , Рис.S1 I ), предполагая, что детерминированность FM также была затронута у мутантов vrs4 . Потеря детерминированности стала еще более очевидной, когда CSM часто образовывали ветвистые меристемы соцветий (BIM) с гребнями (напоминающие стадию преддвухребьевки первичного соцветия) (Рис.2 C и SI Приложение , Рис. S1 C ) , которые позже дифференцировались в тройные холмики (Рис.2 D ) и в конечном итоге дали меристему соцветия vrs4 -подобную ( SI Приложение , Рис.S1 J ). Большинство BIM прервалось по мере продолжения роста ( SI Приложение , Fig. S1 B и C ), и только несколько меристем у основания развились в дополнительные колоски. Подобные аномалии развития наблюдались у двух других vrs4 Bowman около изогенных аллелей BW-NIL ( vrs4.k ) и BW-NIL ( mul1.a ) ( SI Приложение , рис. S2 A . E ). Анализ SEM показал, что мутанты vrs4 и утратили детерминированность TSM, а затем и SM, что привело к появлению лишних колосков и цветков.Выращенный весной мутантный аллель vrs4.l показал усиленный фенотип vrs4 со значительно большим количеством колосков и ветвистых структур, чем у растений, выращенных осенью ( SI Приложение , рис. S1 B и C ). и SI Dataset S1 A ).

Рис. 2.

Сканирующая электронная микроскопия и локализация транскрипта мРНК Vrs4 в незрелых колосьях ячменя. ( A ) Соцветие дикого типа на стадии lemma primordium (LP), показывающее меристему соцветия (IM), образующую двойной гребень (DR), верхний гребень, содержащий меристему тройных колосков (TSM), и нижний гребень листа (LR).TSM образует тройной холмик (TM), который переходит в одну центральную меристему колосков (CSM) и две боковые меристемы колосков (LSM). Пара зачатков чешуек (GP) и единственная цветочная меристема (FM) продуцируются каждым SM. ( B ) vrs4 в LP, инициируя дополнительные меристемы колосков (ASM) (красные стрелки). CSMs развиваются в меристему ветвистого соцветия (BIM). Иногда CSM запускают дополнительные соцветия на рахилле (звездочка). ( C ) vrs4 на стадии зачатка тычинок (SP), показывая BIM на DR и развивающуюся дополнительную меристему цветков (AFM).( D ) vrs4 на стадии примордия ости (AP), показывающая BIM на TM. ( E – H ) Гибридизация РНК in situ HvRA2 в двурядном сорт ячменя. Бонус. Поперечные сечения на DR ( E ), TM ( F ), GP ( G ) и SP ( H ). cs — центральный колоск; ls — боковой колоск; гл, чешуя. ( I ) Уровни транскрипта HvRA2 , определенные количественной ОТ-ПЦР в cv. Бонус. Для нормализации использовали конститутивно экспрессируемый HvActin .Ось X представляет стадии развития спайков. Среднее значение ± стандартная ошибка трех биологических повторов. WA, пыльник белый; GA, пыльник зеленый. ( J ) Экспрессия Vrs1 в BW-NIL ( vrs4.k ) и MFB104 дикого типа. Среднее значение ± стандартная ошибка трех биологических повторов. Значения выражений приведены в нижней части графика. ( K ) Vrs1 (желтый) и Vrs4 (зеленый) экспрессируются в перекрывающихся доменах боковых колосков. ( L ) Шипы сорта. Montcalm несет vrs1.a1 аллель и мутантный аллель vrs4 mul1.a . Дополнительные колоски у mul1.a обозначены красными треугольниками. (Масштаб: 200 мкм в A и B ; 333 мкм в C и D ; и 100 мкм в E – H .)

Помимо неопределенного характера TSM, vrs4 мутанты продемонстрировали еще одну важную особенность полной фертильности и развития боковых колосков, что привело к шестирядному фенотипу.Шестирядный фенотип, наблюдаемый у мутантов vrs4 , был аналогичен фенотипу мутантов vrs1 . В настоящем исследовании все мутантные аллели vrs4 , за исключением int-e.4 , int-e.20 и int-e.72 , показали полный или частичный шестирядный фенотип (рис. H J и SI Приложение , рис. S3).

Генетическое картирование и анализ мутантов показывают, что

Vrs4 лежит в основе ортолога ячменя кукурузы RAMOSA2.

Мы первоначально картировали vrs4 на короткое плечо хромосомы 3H, используя пять картирующих популяций F 2 , состоящих из 188–214 гамет ( SI, приложение , таблица S1). Картированные маркеры были получены из последовательностей синтенных генов Brachypodium (хромосома 2) и риса (хромосома 1) на основе виртуального порядка генов, описанного в «застежке-молнии» генома ячменя (11) (SI Dataset S1 B ). Во всех пяти исследованных картированных популяциях фенотип vrs4 косегрегирован с кластером маркеров (ортологи ячменя Brachypodium / гены риса), происходящих из короткого плеча 3H (37. 17–41,68 см в геномной застежке-молнии) ( SI, приложение , рис. S4). Фланговые маркеры соответствующего кластера маркеров содержали 68 предсказанных генов Brachypodium (от Bradi2g03717 до Bradi2g04380) ( SI, приложение , таблица S2) в пределах интервала. Используя рекомбинантный скрининг в 2172 гаметах ( vrs4.k × популяция Golden Promise), мы дополнительно уточнили интервал и сопоставили vrs4 с одним контигом BAC (1073 kb), содержащим не менее шести предсказанных генов, включая ячмень RAMOSA2 ( HvRA2 ), ВОССТАНОВЛЕНИЕ1 ( RST1 ), ТРИПТОФАН-АМИНО-ТРАНСФЕРАЗА (TPA), ЭМБРИОНАЛЬНЫЙ МЕШОК / БАЗАЛЬНЫЙ ПЕРЕДАЧА ЭНДОСПЕРМА СЛОЙ / ОБЛЕГАЮЩАЯ ОБЛАСТЬ ЭМБРИОНА ( SYN ) КАК БЕЛКОВАЯ КИНАЗА ( INRPK1 ) (рис.3 D ). Из шести предсказанных генов мы рассмотрели HvRA2 как интересный ген-кандидат для локуса Vrs4 , поскольку он был идентифицирован как важный для определения детерминированности идентичности SPM у кукурузы (3).

Рис. 3. Связывание

с высоким разрешением и физическая карта vrs4 и анализ мутантов vrs4 . ( A C ) Райс ( A ) и Brachypodium ( B ) хромосомные области, синтеничные с хромосомой 3H ячменя ( C ) в области vrs4 .Прогнозируемые гены в рисе, хромосомах Brachypodium и ячменя обозначены овалами (названия генов начинаются с Os01g (рис) или Bradi2g ( Brachypodium ) с последующим пятизначным числом). Сплошными черными овалами отмечены гены, из которых были получены маркеры для картирования в области vrs4 . Номера рекомбинантов указаны между картированными маркерами на хромосоме ячменя. ( D ) Одиночный контиг ВАС, секвенированный в области vrs4 (22 перекрывающихся клона ВАС, покрывающих 1073 т.п.н.) (соответствующие названия ВАС см. В приложении SI, таблица S5). Прогнозируемые гены, идентифицированные из последовательностей ВАС, обозначены кружками. ( E ) Структура гена HvRA2 , показывающая отдельный специфичный для травы домен (красный прямоугольник), и RA2 , а также домены LOB. Поражения в 18 мутантных аллелях ORF указаны под структурой гена (см. Также SI, приложение , рис. S5). :, Нуклеотидная замена, приводящая к преждевременному стоп-кодону; *, INDELS приводит к смещению кадра; >, несинонимичный SNP в кодирующей области.

Поскольку мутанты vrs4 в целом показали потерю детерминированности TSM, мы секвенировали HvRA2 в 20 мутантах vrs4 и обнаружили, что 18 показали молекулярные повреждения в пределах ORF HvRA2 (рис.3 E и SI Приложение , рис. S5). Было высказано предположение, что количество зачатков меристемы, дающих начало колоскам, частично не ограничено у мутантов vrs4 , что приводит к образованию дополнительных колосков / цветков (7). Из анализа мутантов мы обнаружили, что независимо от типа поражения в различных мутантных аллелях vrs4 , все они в определенной степени демонстрировали неопределенность TSM (Рис. 1 H J и SI Приложение , Инжир.S3). Молекулярная природа повреждений у мутантов четко коррелировала с тяжестью фенотипа vrs4 . Пять мутантов с наиболее сильным фенотипом колосков имели преждевременный стоп-кодон [BW-NIL ( vrs4.k ), BW-NIL ( mul1.a ), vrs4.1 ( syn . Xc 41,5 ). ), int-e.26 и int-e.128 ( син. Hex-v.48 )] или предполагаемую делецию гена (MHOR 318 и MHOR 345; фиг. 1 H J и 3 E и SI Приложение , рис.S3). Более слабые аллели обладали аминокислотными заменами либо в LOB-домене [ int-e.23, BW-NIL ( int-e.58 ), int-e.72 ], либо в других консервативных областях (см. Ниже) белка ( int-e. 65, int-e.66, int-e.87 , int-e.89, int-e.90 , int-e.91, int-e.92 , int-e.101 ) (Рис.3 E и SI Приложение , Рис. S3). Мутанты vrs4 int-e.4 и int-e.20 не показали никаких повреждений, что указывает на возможную транскрипционную или посттранскрипционную регуляцию этих аллелей (данные об аллелизме для int-e.4 и int-e.20 с vrs4 находятся в приложении SI ). Коллекция из 18 мутантов ORF убедительно показала, что HvRA2 лежит в основе локуса Vrs4 .

HvRAMOSA2 кодирует фактор транскрипции LOB-домена со специфическими для травы доменами.

HvRA2 представляет собой белок LOB-домена класса I, состоящий из богатого цистеином повтора (CX2CX6CX3C), высококонсервативного блока GAS и мотива спиральной спирали лейциновой молнии (LX6LX3LX6L) ( SI, приложение , рис.S6), сигнатуры сохраняются во всех белках LOB-домена класса I (12). Помимо канонического LOB-домена, травы (однодольные) обладают уникальным C-концевым предполагаемым доменом активации (44 аминокислотных остатка), который отсутствует у Arabidopsis и других эвдикотов (3) ( SI, приложение , рис. S6). Основываясь на выравнивании последовательностей, полученных из ортологичных / гомологичных белков RA2 из ряда видов однодольных и эвдикотов, мы идентифицировали еще одну консервативную N-концевую область, специфичную для травы (16 аминокислотных остатков), предшествующую домену LOB (рис.3 E и SI Приложение , рис. S6). Последние четыре аминокислоты N-концевого домена (PGAG) строго консервативны у разных видов трав. Интересно, что семь из мутантов vrs4 обладали аминокислотными заменами в последних четырех аминокислотах консервативной N-концевой области, что указывает на его предполагаемую функциональную роль в травах. Филогенетический анализ гомологов / ортологов RA2 у эвдикотов и однодольных сгруппировал их в клады, специфичные для однодольных и эвдикотов ( SI Приложение , рис. S7). Среди 23 генов, кодирующих LOB-домен (LBD; 19 класс I и четыре класса II) из ячменя ( SI, приложение , таблица S3), HvRA2 был уникальным с консервативными N- и C-концевыми доменами и четко отделен от других ячменя и эвдикота. Члены семейства LBD ( SI, приложение , рис. S7 и таблица S3).

Повторное секвенирование

HvRA2 в различных генотипах ячменя показывает снижение нуклеотидного разнообразия.

Пытаясь идентифицировать специфичные для типа ряда аллели Vrs4 в естественной вариации, мы провели анализ последовательности ORF HvRA2 и частей 5 ‘и 3’ регуляторных областей (промотор, UTR) в наборе 77 различных генотипов двурядного и шестирядного ячменя (SI Dataset S1 C ).В отличие от Vrs1 и Int-c , которые показали специфические для ряда типов аллели в естественной вариации (9, 10), Vrs4 оказались консервативными в разнообразной двухрядной и шестирядной зародышевой плазме, обнаруживая очень низкий уровень естественных нуклеотидов. вариации в кодирующей области (SI Dataset S1 C ). Анализ гаплотипов с использованием этих данных последовательностей привел к получению одного основного и семи второстепенных нуклеотидных гаплотипов (инвентарные номера GenBank от KC854546 до KC854553) без специфичности по отношению к конкретному географическому региону или типу строки ( SI, приложение , рис.S8 и SI Dataset S1 C ). Среди восьми идентифицированных нуклеотидных гаплотипов только один гаплотип, состоящий из двухрядного генотипа, Palmella Blue, кодирует аминокислотную замену в неконсервативной области белка, не оказывая какого-либо влияния на фенотип дикого типа (см. SI Dataset S1 C для выравнивания последовательностей белков нуклеотидных гаплотипов). Мы обнаружили полную консервацию в 3’UTR, предполагая, что это может быть сайт-мишень для цис- -регуляторных элементов или участвовать в метаболизме мРНК.

HvRA2 выражается на ранней стадии разработки Spike и функционирует до Vrs1.

Анализ гибридизации in situ показал, что первая экспрессия HvRA2 была обнаружена на стадии двойного гребня, когда зачатки колосков начинают дифференцироваться (рис. 2 E ), что делает HvRA2 одним из самых ранних экспрессируемых генов во время AM дифференциация. На стадии тройного холмика, когда зачатки колосков дифференцируются на три отдельные меристемы колосков, сигналы мРНК HvRA2 были многочисленны по всем боковым зачаткам колосков с более слабой экспрессией в центральных зачатках колосков (рис.2 F ), что указывает на роль в обеспечении определенности и ограниченности TSM. На стадии зачатка чешуек, во время которой зародыши цветков инициируются, мРНК HvRA2 были обнаружены как в центральных, так и в боковых колосках (рис. 2 G ). Уровни транскрипта HvRA2 в развивающихся шипах на стадиях тройного холмика и зачатка чешуи были относительно выше, чем на более поздних стадиях (Fig. 2 I ).

Анализируя различные шестирядные мутанты, Sakuma et al.заметили, что транскрипты Vrs1 и были особенно подавлены на фоне мутанта vrs4 (13). Мы также обнаружили, что Vrs1 транскриптов в BW-NIL ( vrs4.k ) были значительно снижены на разных стадиях развития спайков (Fig. 2 J ). В отличие от HvRA2 (Fig. 2 E ), экспрессия Vrs1 в растениях дикого типа начинается на стадии тройного холмика без детектируемой экспрессии на стадии двойного гребня (9). Таким образом, экспрессия HvRA2 временно опережает Vrs1 .Более того, транскриптов HvRA2 и на стадии тройного холмика в основном локализованы в латеральных колосках (Fig. 2 F ), подтверждая перекрытие домена экспрессии между белками VRS1 и HvRA2 (Fig. 2 K ). В соответствии с этим, большинство мутантов vrs4 показали полный шестирядный фенотип, аналогичный мутантам vrs1 (Рис.1 H J и SI Приложение , Рис. S3), что указывает на то, что Vrs1 Расшифровка требует действия HvRA2.Двойной мутантный анализ подтвердил эту точку зрения, поскольку аллель vrs4 BW-NIL ( mul1.a ), выделенный на шестирядном фоне (прародитель: Montcalm, vrs1.a1 ), демонстрировал шестирядный спайк с полным латеральная фертильность колосков, наблюдаемая у Montcalm, а также неопределенность TSM, диагностика мутантов vrs4 (рис. 2 L ).

Анализ микроматрицы

vrs4 показывает, что HvRA2 является важным регулятором развития соцветий.

Поскольку Vrs4 кодирует фактор транскрипции LOB-домена HvRA2, мы выполнили микроматричный анализ двух делеционных мутантов vrs4 , MHOR 318 и MHOR 345, и их соответствующих диких типов, Ackermann’s Donaria и Heine’s Haisa, для определения его потенциальной последующей мишени. гены ячменя. Из данных микроматрицы мы обнаружили убедительные доказательства опосредованной Vrs4 регуляции Vrs1 у обоих проанализированных мутантов с очень значительным подавлением Vrs1 у мутантов vrs4 ( SI Приложение , рис.S9 A ). Важно отметить, что среди других генов, значительно подавляемых у обоих мутантов, мы идентифицировали трегалозо-6-фосфат (T6P) синтазу и HvSRA (предполагаемую фосфатазу T6P) ( SI Приложение , рис. S9, A ), оба вовлечены в в биосинтезе трегалозы, что предполагает возможную регуляцию гомеостаза Т6Р с помощью Vrs4 во время развития и роста соцветий (14, 15). Из данных экспрессии микроматрицы мы идентифицировали другие важные по-разному регулируемые гены у обоих мутантов vrs4 , которые, вероятно, могут функционировать в установлении детерминированности рядового типа и колосковой детерминации у ячменя.

Другим важным дифференцированно регулируемым геном у обоих мутантов vrs4 был EGG APPARATUS1-LIKE ( EA1-LIKE ). EA1 кодирует секретирующий белок, который привлекает рост пыльцевых трубок к аппарату яйца (16). Значительное подавление гена EA1-LIKE в двухрядном соцветии дикого типа ( SI Приложение , рис. S9 B ) предполагает, что и Vrs1 , и EA1-LIKE могут функционировать в аналогичный путь.В соответствии с этим феноменом, транскриптов Vrs1 и обнаруживают локализацию на пестиках боковых колосков ячменя (13). Альтернативно, повышенная экспрессия EA1-LIKE может быть связана с пролиферирующими дополнительными колосками / цветочками у мутантов vrs4 .

Дифференциально регулируемые гены, которые, вероятно, участвуют в усилении меристематической активности мутантов vrs4 , включают LONELYGUY-LIKE ( LOG-LIKE ), который кодирует фосфорибогидролазу цитокининовых нуклеотидов, фермент биосинтеза цитокининов, необходимый для поддержания активности меристема 17. .Повышение регуляции генов LOG-LIKE у мутантов vrs4 и показало, что более высокие количества транскриптов LOG-LIKE способствовали меристематической активности у мутантов vrs4 (приложение SI , фиг. S9 B ). LOG1 необходим для накопления транскриптов гомеобокса типа KNOTTED1 ( KNOX ) в рисе (17). Таким образом, избыточная продукция цитокинина приводит к увеличению устойчивых уровней транскриптов гена KNOX (18).Напротив, было показано, что белки KNOX активируют биосинтез цитокининов в апикальной меристеме побега Arabidopsis и риса (19, 20). Таким образом, KNOX и цитокинин могут действовать в петле положительной обратной связи, при этом генов KNOX способствуют биосинтезу цитокининов, а цитокинины активируют биосинтез KNOX . Наши данные показали повышенную регуляцию KNAT3 ( KNOX ) у мутантов vrs4 ( SI Приложение , рис. S9 B ), что указывает на возможную совместную регуляцию белков LOG-LIKE и KNOX у мутантов vrs4 . .Анализ микроматрицы для этих дифференциально регулируемых генов подтверждается количественными данными ОТ-ПЦР ( SI, приложение , рис. S10).

Независимые количественные анализы RT-PCR нескольких важных генов (отсутствующих на микрочипе и идентифицированных на основе экстраполяции мутантного фенотипа vrs4 с известными генами архитектуры мутантного соцветия, характерными для риса или кукурузы) выявили дифференциальную регуляцию цитокининоксидазы / дегидрогеназы ( CKX2 ), который участвует в деградации цитокининов и размере меристемы (21). HvCKX2 Уровни транскрипта в BW-NIL ( vrs4.k ) и MHOR 318 были снижены ( SI, приложение , фиг. S11), что согласуется с более высокой меристематической активностью в мутантном соцветии. Транскрипты другого гена, PINFORMED1-LIKE ( PIN1-LIKE ) (22), также были активированы в мутантах vrs4 , что позволяет предположить, что измененный транспорт ауксина влияет на развитие латеральных органов у мутантов vrs4 ( SI Приложение , рис. S11).

Обсуждение

Регуляция развития соцветий широко изучена у видов растений, таких как Arabidopsis и кукуруза (23), с помощью множества мутантов, которые демонстрируют аномальное развитие соцветий. Однако у ячменя функциональные знания о генах и генетических механизмах, участвующих в развитии колосков, начали появляться относительно недавно, с клонированием таких генов, как Vrs1 (9) и Int-c (10).Мутанты vrs4 , как и другие мутанты ряда ячменя, дают фенотип с шестью рядами, но наиболее интересным фенотипом является неопределенный TSM, приводящий к образованию дополнительных колосков / цветков, которые часто развиваются в зерна. Таким образом, действия vrs4 , возможно, вместе с другими, еще неизвестными генами, могут помочь выяснить, как увеличить потенциал урожайности ячменя и других видов Triticeae.

Наши данные повторного секвенирования показали очень ограниченную естественную изменчивость HvRA2 в разнообразной зародышевой плазме ячменя с полной сохранностью в 3’UTR. Низкий уровень полиморфизма в 3′-регуляторной области наблюдался также в локусах доместикации кукурузы RA1 (24) и GRASSY TILLERS1 (25). Мы предполагаем, что естественные вариации в этом локусе могли пройти очищающий отбор у двух- и шестирядных ячменей, поскольку тяжелые мутации нарушили бы детерминированность TSM, что привело бы к неупорядоченному образованию колосков. Однако более слабые природные мутантные аллели vrs4 все еще могут быть скрыты среди промежуточных ячменя, которые представляют собой большой и разнообразный фенотипический класс рядового типа в культивируемом ячмене.

Другим важным открытием настоящего исследования является регуляция транскрипции Vrs1 с помощью HvRA2. Наш анализ микроматрицы подтвердил, что Vrs1 значительно подавляется у мутантов vrs4 . Результаты гибридизации мРНК HvRA2 in situ показали, что HvRA2 и Vrs1 экспрессируются в сильно перекрывающихся доменах латеральных колосков, что указывает на предполагаемое взаимодействие. Косвенные доказательства, подтверждающие эту точку зрения, были получены из мотива распознавания консенсусной ДНК LOB-домена 5′-CCGGCG-3 ‘(26), присутствующего в промоторной области Vrs1 , близкой к сайту начала транскрипции (от -60 до -65 п.н.), а также в 5′UTR.Предыдущие анализы связывания белков in vitro показали сильную аффинность связывания белков LOB-домена с этим консенсусным мотивом (26). Однако необходимо установить физическое взаимодействие между HvRA2 и Vrs1 cis элементами. Очевидно, редукция Vrs1 транскриптов в vrs4 мутантов указывает на то, что HvRA2 прямо или косвенно контролирует Vrs1 транскриптов и, таким образом, путь типа ряда (Fig. 4 A и B ).

Рис. 4.

Модели взаимодействий Vrs4 , демонстрирующие предполагаемые цели HvRA2 .( A ) Функциональный Vrs4 подавляет образование дополнительных колосков и активирует транскрипцию Vrs1 . ( B ) Мутант vrs4 не может контролировать детерминированность TSM; таким образом, образуются дополнительные колоски. Активация транскрипции экспрессии Vrs1 опущена (красный крест), что приводит к фертильности латеральных колосков. ( C ) HvRA2 может регулировать транскрипты T6P-синтазы (T6PS) и HvSRA , предполагаемой фосфатазы T6P, тем самым поддерживая гомеостаз T6P и детерминированность колосков.В Vrs4 уровни транскрипции PIN1-LIKE поддерживаются на постоянном уровне, но повышаются в vrs4 . У растений дикого типа HvRA2 функционирует выше HvHox1 , что, в свою очередь, может подавлять транскрипты EA1-LIKE , что приводит к аборту боковых колосков, возможно, к образованию двухрядных колосков (гипотетически). Однако усиление регуляции EA1-LIKE у мутантов vrs4 и , вероятно, может быть связано с повышенной меристематической активностью, связанной с фенотипом шестирядных колосков и дополнительными колосками / цветочками.Уровни транскриптов генов, участвующих в меристематической активности [например, генов цитокининоксидазы ( CKX2 ), генов LONELY GUY-LIKE и KNOX ], также регулируются HvRA2 .

У кукурузы морфология соцветий в значительной степени регулируется путем RAMOSA при скоординированной регуляции RA1 , RA2 и RA3 . Кукуруза RA3 демонстрирует высоколокализованный паттерн экспрессии в основании ветвей соцветий и кодирует функциональную фосфатазу Т6Р, что указывает на роль передачи сигналов трегалозы в детерминированности меристемы (5).Четкий ортолог RA3 отсутствует в ячмене. Однако гомолог RA3 , названный SISTER OF RAMOSA3 ( SRA ), был идентифицирован в ячмене ( HvSRA ) и родственных ему злаках (5). Гомолог RA3 риса ( OsSRA ) также показал высоколокализованный паттерн экспрессии у основания ветвей соцветия (5), что указывает на его роль в формировании паттерна соцветий. У кукурузы транскрипты RA1 и находятся под контролем RA2 и RA3 , посредством чего RA2 контролирует судьбу SPMs посредством комплекса детерминированности RA1-REL2 (4).SPM специфичен для трибы Andropogoneae, как и RA1 (1, 2). Таким образом, HvRA2, по-видимому, поддерживает консервативную функцию (контроль над детерминированностью меристемы), но диверсифицирует последующие цели для выполнения этой функции у ячменя (поскольку ортолог / гомолог RA1 отсутствует в ячмене). В большой коллекции мутантов ячменя несколько мутантов с многоцветковым или разветвленным колосом, например extra floret ( flo ) -a , flo-b , flo-c , compositum1 ( com1 ), com2 и multiflorus2 ( mul2 ), но гены, лежащие в основе этих мутантов, до сих пор не идентифицированы.Эти локусы могут быть потенциальными мишенями-кандидатами Vrs4 для придания детерминированности колоску. Хотя RA2 и RA3 действуют в кукурузе независимо, мы обнаружили, что HvRA2 может регулировать транскрипты HvSRA и T6P-синтазы, которые, в свою очередь, могут регулировать специфические реакции роста посредством синтеза T6P (рис. 4 C ). (27). Более того, HvRA2 кооперирует специфичную для рода функцию для пути ряда посредством регуляции Vrs1 (контроль над фертильностью боковых колосков), тем самым четко указывая на различные наборы генов и сети для развития соцветий по сравнению с кукурузой (рис.4 С ). Кроме того, мы показали различия транскриптов для HvCKX2 и транспортеров ауксина у мутантов vrs4 , что дополнительно указывает на их роль в росте и развитии соцветий (Рис. 4 C ).

В совокупности наши результаты показывают, что Vrs4 играет центральную роль в создании архитектуры соцветий колосьев ячменя, а также в определении потенциала урожайности и количества зерен. Таким образом, лучшее понимание основных регуляторных сетей генов во время формирования колоса может помочь улучшить будущие урожаи мелкозерновых зерновых.

Материалы и методы

Растительный материал.

Аллельные мутанты vrs4 ( SI, приложение , таблица S4) были получены из Северного центра генетических ресурсов, Национальной коллекции мелкого зерна (Министерство сельского хозяйства США) и генного банка IPK. Семьдесят семь различных образцов ячменя были получены из банка генов IPK для анализа гаплотипов. Мутантные аллели vrs4.l ( syn . Xc 41,5 ), его двухрядный предшественник Piroline и изолинии Боумена BW-NIL ( vrs4.k ) и BW-NIL ( mul.1a ) были использованы для фенотипических описаний и анализа SEM. Растительный материал, используемый для создания картографических популяций, обсуждается в Приложении SI .

Vrs4 Фенотипическая характеристика.

vrs4.1 был выбран в качестве эталона для сравнения развития соцветий с пиролином дикого типа. Пиролин и vrs4.l выращивали на полях в Цукубе, Япония, в осенний (октябрь 2011 г. — июнь 2012 г.) и весенний (с марта 2012 г. по июнь 2012 г.) сезоны.Для анализа, показанного на рис. 1 O и SI Dataset S1 A , данные были записаны для пяти растений (два колоса на растение) каждого из генотипов. Значения вероятности определялись с помощью теста т . Подсчитывали количество междоузлий рахиса и количество семян, полученных мутантом и диким типом. Тройка колосков, состоящая из трех колосков, считалась базовым набором подмышечных структур, а остальные подмышечные структуры считались дополнительными подмышечными структурами.Каждый триплет или мультиспиклет делили на один центральный и два боковых блока, и в каждом блоке подсчитывали количество дополнительных колосков / цветков. Дополнительную подмышечную структуру считали лишним цветком, когда рахилла первой подмышечной структуры не была видна. Было подсчитано общее количество ветвистых структур и дополнительных леммоподобных структур, образованных шипом. Плодовитость подмышечной структуры оценивали путем подсчета количества семян, полученных от каждого типа подмышечной структуры.

Количественная ОТ-ПЦР.

Тотальную РНК экстрагировали из незрелых тканей колоса (двойной гребень, тройной холмик, зачаток чешуи, зачаток леммы, зачаток тычинок и зачаток ости) с использованием набора PureLink RNA Mini (Invitrogen). Для удаления загрязнения геномной ДНК использовали ДНКазу, не содержащую РНКаз (Invitrogen). Целостность и количество РНК измеряли с помощью Agilent Bioanalyzer и NanoDrop (Peq Lab) соответственно. Обратную транскрипцию и синтез кДНК проводили с 1 мкг РНК с использованием набора для обратной транскрипции QuantiTect (Qiagen).ПЦР в реальном времени выполняли с использованием набора для ПЦР QuantiTect SYBR Green (Qiagen) и системы определения последовательности ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Результаты ОТ-ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения SDS2.2 (Applied Biosystems). Количественные последовательности праймеров ОТ-ПЦР перечислены в SI Dataset S1 B .

мРНК in situ Гибридизация.

Сегмент гена Vrs4 , включающий части первого и второго экзонов (395 п.н.), амплифицировали из кДНК, выделенной из cv. Используйте специальные праймеры для увеличения незрелых шипов (SI Dataset S1 B ).Продукт ПЦР клонировали в вектор pBluescript II KS (+) (Stratagene). Клоны, линеаризованные с помощью EcoRI или NotI, использовали в качестве матриц для создания антисмысловых (EcoRI) и смысловых (NotI) зондов с использованием РНК-полимеразы Т3 или Т7. Гибридизацию in situ проводили, как описано (9).

BAC Секвенирование, сборка и аннотации.

Одиночный контиг ВАС, охватывающий 1073 т.п.н. минимального тайлинга хромосомы 3H ячменя, был секвенирован с использованием дробовика с использованием технологии 454 ( SI, приложение , таблица S5) (32) и собран, как описано (33). ORF из последовательностей BAC были предсказаны с использованием веб-сервера Genescan (34). Предсказанные гены были аннотированы с использованием функции BLASTX Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

Филогенетический анализ.

LBD-генов ячменя экстрагировали с сервера BLAST IPK ячменя с использованием HvRA2 в качестве запрашиваемой последовательности. Белок HvRA2 использовали в качестве запроса NCBI BLASTp для извлечения белков RA2 и RA2-LIKE (отсечка E-значения 10 -30 ) из однодольных и эвдикотов соответственно ( SI, приложение , таблица S6).Для филогенетического анализа последовательности белков были первоначально выровнены с использованием алгоритма MUSCLE, реализованного в MEGA 5.1 (35). Филогенетическое дерево максимального правдоподобия (ML) было построено с использованием эвристического метода ML (Nearest Neighbor Interchange, NNI), реализованного в MEGA 5.1. Дерево консенсуса начальной загрузки, выведенное из 1000 повторов, используется для представления эволюционной истории анализируемых последовательностей. Ветви, соответствующие разделам, воспроизведенным менее чем в 50% репликах начальной загрузки, сворачиваются.

Сканирующая электронная микроскопия.

Незрелые ткани колоса на пяти стадиях (тройной бугорок, чешуйка, лемма, тычинка и зачаток ости) выращенных в поле и в теплице растений использовали для сканирующей электронной микроскопии (SEM). СЭМ проводили, как описано (36).

Благодарности

Мы благодарим д-ра С. Р. Палаколану (Международный научно-исследовательский институт сельскохозяйственных культур полузасушливых тропиков) за помощь в филогенетическом анализе; Доктору Б. Килиану (ИПК Гатерслебен) за предоставление зародышевой плазмы для анализа гаплотипов; ЧАС.Bockelman (Министерство сельского хозяйства США — Служба сельскохозяйственных исследований) и генный банк IPK для предоставления исходной мутантной зародышевой плазмы; И. Вальде за помощь в эксперименте с VeraCode; П. Гавронски за полезные обсуждения; и Х. Эрнсту, Х. Кояме, С. Кёнигу, К. Липферт, М. Пуффельду, М. Пюршелю, К. Траутевигу и К. Вайследеру за отличную техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами Министерства образования (IZN), Саксония-Ангальт (Н. Шринивасулу), Министерства сельского, лесного и рыбного хозяйства Японии (Грант на геномику для сельскохозяйственных инноваций TRG1004; Т.K.), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG Grant SCHN 768 / 2-1; T.S.) и BMBF (Федеральное министерство образования и исследований Германии, GABI-FUTURE Start_Young Investigator Program Grant 0315071; T.S.).

Сноски

  • Вклад авторов: Н. Шринивасулу, Т.К. и Т.С. спланированное исследование; R.K., N.A., S.S., A.T., U.L., M.P., T.R., C.S., A.H., R.A. и H.M.Y. проведенное исследование; Н. Штейн внес новые реактивы / аналитические инструменты; Р.К., Н.А., С.С., А.Т., У.Л., М.П., ​​Н. Шринивасулу, Т.К., Т.С. проанализированные данные; and R.K., N.A., S.S., N. Sreenivasulu, T.K., and T..S. написал газету.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

  • Размещение данных: Последовательности, представленные в этой статье, были депонированы в базе данных GenBank (инвентарные номера: KC854546 – ​​KC854554).

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1221

    0/-/DCSupplemental.

Доступно бесплатно в Интернете через опцию открытого доступа PNAS.

Контроль судьбы меристемы колосков кукурузы с помощью APETALA2-подобного гена undeterminate spikelet1

  1. Джордж Чак,
  2. Роберт Б. Мили и
  3. Сара Хейк
  1. Департамент биологии растений и микробов, Калифорнийский университет, Беркли, Калифорния

    , США;
    Pioneer Hi-Bred International, Джонстон, Айова 50131, США;
    Центр экспрессии генов растений, Министерство сельского хозяйства и Служба сельскохозяйственных исследований США (USDA-ARS), Олбани, Калифорния

    ,
    Соединенные Штаты Америки

Абстрактные

Упорядоченное производство меристем с определенной судьбой имеет решающее значение для правильной разработки архитектуры растений. Кукуруза
меристема соцветия разветвляется несколько раз, образуя боковые меристемы с определенными судьбами. Образовалась первая меристема,
меристема пары колосков дает две меристемы колосков, каждая из которых дает две цветочные меристемы. Мы определили
ген, названный undeterminate spikelet1 ( ids1 ), который определяет детерминированную судьбу меристемы колосков и тем самым ограничивает количество продуцируемых цветочных меристем.В отсутствие
Из-за функции гена ids1 меристема колосков становится неопределенной и дает дополнительные соцветия. Члены семейства злаковых различаются
по количеству цветков в их колосках, предполагая, что ids1 могут играть роль в архитектуре соцветий у других видов трав. ids1 является членом семейства генов транскрипционных факторов APETALA2 ( AP2 ), которые участвуют в широком диапазоне ролей в развитии растений.Выражение
ids1 обнаружен во многих типах зачатков боковых органов, а также в меристемах колосков. Наш анализ мутантного фенотипа ids1, и паттерна экспрессии показывает, что ids1 специфицирует детерминированные судьбы путем подавления неопределенного роста в меристеме колосков.

Развитие тела растения зависит от активности апикальных меристем, групп неопределенных клеток, обнаруженных на
советы по выращиванию.Способность апикальных меристем побегов оставаться неопределенными позволяет им постоянно инициировать органы,
ткани и вторичные меристемы, необходимые для нормального развития. Это свойство требует, чтобы меристема выделяла популяцию.
клеток, чтобы обновиться и восполнить потери клеток в каждом боковом органе или вторичной меристеме. Провал этого процесса
произойти приводит к прекращению роста кончика. Некоторые меристемы, например цветочные меристемы, потребляются при производстве
боковых органов и могут быть описаны как имеющие определенную судьбу.Соцветие кукурузы особенно полезно для
изучение детерминированности меристемы, поскольку она претерпевает несколько четко определенных событий ветвления, чтобы произвести меристемы со все более
ограниченные судьбы.

Соцветия травы организованы в группы, называемые колосками, каждый из которых состоит из пары стерильных прицветников, называемых чешуйками, покрывающими
фиксированное количество цветков (Clifford 1987). Регулирование количества цветков на колоске является основным фактором, определяющим архитектуру колосков среди членов травы.
семья.Колосок кукурузы является детерминантным, дает только два цветочка в определенных положениях на оси, называемой рахиллой.
(Weatherwax 1923). Родственники кукурузы характеризуются колосками с неопределенным количеством цветков, например пшеница, или содержат только
по одному цветочку на колоск, как у ячменя. Один из классических критериев, используемых для различения различных видов трав, заключается в том,
колоски содержат определенное или неопределенное количество цветков (Clifford and Watson 1977).Сам колоск — лишь один из компонентов сложного разветвленного соцветия кукурузы. В отличие от двудольных
у таких растений, как Arabidopsis , у которых цветки образуются непосредственно апикальной и боковой меристемами (Hempel and Feldman 1994), у кукурузы есть по крайней мере две отчетливые стадии ветвления соцветий до того, как меристема колосков завершится в производстве.
из двух цветочков. Эти дополнительные ступени ветвления обеспечивают большее морфологическое разнообразие трав.

У кукурузы был описан ряд мутантов, которые приводят к появлению дополнительного количества цветков внутри колоска (Veit et al. 1993). У разветвленных бесшелковых мутантов дополнительные цветочки зарождаются в мужских колосках кисточки (Kempton 1934), хотя более радикальная трансформация наблюдается в женских колосках уха, у которых цветочки превращаются в длинные
индетерминантные ветви (Veit et al. 1993). Исследования мутации Tasselseed6 показали, что меристема колосков задерживается в достижении детерминированности, что позволяет ей инициировать образование цветков.
в течение более длительного периода времени (Irish et al.1994). Анализ мутантов Tasselseed6 привел к модели (Irish 1997), в которой меристема соцветия и ее производные ветви проходят через упорядоченную, определенную серию детерминированных стадий развития.
состояний, заканчиваясь превращением терминальной меристемы колосков в верхний цветочек. Подобные ветвящиеся мутанты имеют
также описаны для других видов трав и включают мутацию многоцветкового ячменя (Bossinger et al. 1992) и доминирующий мутант Naked овса (Ougham et al.1996).

Множество генетических и молекулярных исследований выявило несколько генов, важных для развития цветков. Один такой ген,
гомеотический ген APETALA2 ( AP2 ) из Arabidopsis, выполняет несколько функций в развитии цветков, семян и семяпочек (Kunst et al. 1989; Jofuku et al. 1994; Modrusan et al. 1994). Помимо своей роли в определении идентичности цветочных органов, AP2 влияет на регуляцию идентичности цветочной меристемы.Например, двойные мутанты слабого аллеля ap2-1 с мутантами идентичности цветочной меристемы, такие как листовой или apetala1 , производят больше боковых ветвей соцветия вместо цветков (Bowman et al. 1993). Кроме того, слабые аллели ap2 в короткие дни вызывают образование третичных цветочных побегов в пазухах трансформированных чашелистиков (Schultz and Haughn 1993). Ген AP2 принадлежит к большому семейству генов, 12 из которых были идентифицированы в Arabidopsis (Okamuro et al.1997). Многочисленные гомологи были идентифицированы как у однодольных, так и у двудольных (Jofuku et al. 1994; Ohme-Takagi and Shinshi 1995; Moose and Sisco 1997). Мутации в AP2 -подобном гене, AINTEGUMENTA, являются дефектными в развитии яйцеклетки (Elliot et al. 1996; Klucher et al. 1996). Недавно было показано, что ген glossy15 кукурузы является геном, подобным AP2 , который функционирует, подавляя признаки взрослых листьев у молодых листьев (Moose and Sisco 1997).

Здесь мы описываем новый мутант ветвления кукурузы, undeterminate spikelet1 ( ids1 ), который мы получили в результате анализа фенотипа, обусловленного потерей функции гена, подобного AP2 кукурузы. ids1 мутанты имеют неопределенный колоск, в котором образуется несколько цветков вместо двух, обнаруженных у кукурузы дикого типа.
ids1 Экспрессия наблюдалась во множестве боковых органов, а также в паре колосков и меристемах колосков. Наш анализ
указывает на то, что ген ids1 является критическим для регуляции детерминированности меристемы колосков кукурузы.

Результаты

Выделение гена

ids1

Ген AP2 из Arabidopsis использовали для скрининга двух библиотек кДНК кукурузы с низкой строгостью, одна получена из незрелых початков, а другая — из вегетативных.
меристемы.Один и тот же класс кДНК был выделен из каждой библиотеки. Самый длинный клон этого класса состоял из 1967 нуклеотидов и
содержала ORF из 433 аминокислот (фиг. ) с несколькими доменами, демонстрирующими поразительное аминокислотное сходство с геном AP2 Arabidopsis (Jofuku et al. 1994). Были обнаружены два тандемно повторяющихся мотива из 68 аминокислот, которые на 86% идентичны аминокислотам с доменом AP2 белка Arabidopsis AP2. Семейство генов AP2 можно разделить на две группы, обозначенные как EREBP-подобные или AP2-подобные, в зависимости от того, обладают ли они
один или два повтора AP2 соответственно (Okamuro et al.1997). Белок IDS1 относится к последнему классу, который включает белки AP2, AINTEGUMENTA, GLOSSY15 и RAP2.7 (рис.)
(Jofuku et al. 1994; Klucher et al. 1996; Moose and Sisco 1997; Okamuro et al. 1997). Белки табака ERE-BP, которые имеют только один из этих повторов, связывают ДНК (Ohme-Takagi and Shinshi 1995). Таким образом, по аналогии вполне вероятно, что IDS1 функционирует как фактор транскрипции. В подтверждение этого краткий отрезок основных
аминокислоты, которые могут функционировать как домен ядерной локализации, присутствуют в белке IDS между 100 и 110 аминокислотами.
(Рис.). Белок AP2 из Arabidopsis содержит богатый серином кислотный домен на аминоконце, который может функционировать как домен активации (Jofuku et al. 1994). Хотя подобный участок находится на аминоконце белка IDS1 в положениях 9–45, этот участок намного меньше
и имеет меньше кислотных и сериновых остатков по сравнению с AP2. За пределами домена AP2 наблюдается очень небольшое сходство последовательностей
между AP2 и IDS1. Учитывая это открытие, удивительно, что положения шести интронов в домене AP2 сохраняются.
между ids1 и AP2 (рис.). Аналогичный результат был получен для гена gl15 кукурузы (Moose and Sisco 1997).

Нуклеотид и выведенная аминокислотная последовательность IDS1. Аминокислотные числа показаны слева от ; нуклеотид пронумерован справа . Подчеркнутые аминокислотные последовательности представляют два домена AP2 (Jofuku et al.1994). Серины и кислые аминокислоты на амино-конце обозначены коротким подчеркиванием. Аминокислотные последовательности выделены жирным шрифтом
представляют собой основной регион с предполагаемой активностью ядерной локализации. Полужирные нуклеотидные последовательности соответствуют ZAP2-1.
праймер, используемый для скрининга ПЦР. (▿) шесть положений интрона, сохраненные между IDS, AP2, и GL15; (▾) другой интрон.

Сравнение между доменами AP2 AP2 -подобных генов.Выведенные аминокислотные последовательности доменов AP2 IDS1 (номер доступа в GenBank AF048900), RAP2.7 (AF003100), GL15 (U41466) и ANT (U40256) сравниваются с AP2 (ATU12546). Область между двумя повторами AP2, то есть линкерная область, начинается с аминокислоты
78 и заканчивается на 102. Для облегчения совмещения были введены зазоры, представленные точками. Аминокислоты, общие для всех пяти
белки выделены жирным шрифтом и на согласованной последовательности внизу .

ids1 был картирован на длинном плече первой хромосомы в положении 192 с использованием рекомбинантных инбредных линий (Burr et al. 1988), зондированных неповторяющимся фрагментом ДНК с 3′-конца ids1. Никакие известные морфологические мутанты не были картированы в этой позиции.

Выделение рецессивных

ids1 мутаций

Чтобы выяснить функцию ids1, , мы использовали обратную генетическую стратегию для генерации аллелей с потерей функции. ПЦР использовали на большой популяции растений, несущих
Mutator ( Mu ) транспозоны для поиска вставок в ID1 (Bensen et al.1995; Мили и Бриггс 1995). Праймеры, фланкирующие домен AP2 ID1 в комбинации с праймерами Mu , дали два независимых события вставки на этом скрининге. Секвенирование продуктов ПЦР позволило локализовать вставки.
точнее. Как показано на рисунке, вставка Mu в ids1-mum1 была локализована на пятом консервативном интроне домена AP2 , тогда как вставка ids1-mum2 была локализована на первом консервативном интроне на расстоянии 6 п.н. акцепторный сайт сплайсинга.Поскольку элементов Mu генерируют дупликацию 9 bp при вставке (Bennetzen et al. 1993), акцепторный сайт сплайсинга также обнаруживается на 5′-конце Mu.

Локализация элементов Mu в ids1 – mum1 и ids1 – mum2. ids1 последовательности интрона и экзона показаны нормальным и жирным шрифтом соответственно.Номера интронов и экзонов показаны выше.
последовательности ДНК. Подчеркнутые последовательности представляют характерную дупликацию 9 п.н., связанную со вставками Mu .

Линии, несущие аллели ids1 – mum1 и ids1 – mum2 , демонстрировали рецессивный цветочный фенотип, который был более серьезным в линиях ids1 – mum2 .Чтобы убедиться, что вставки в ids1 отвечают за цветочный фенотип, мы проанализировали ДНК из 104 растений F2, используя ген ids1 в качестве зонда на гель-блотах ДНК. Косегрегация новых RFLP с цветочным фенотипом наблюдалась для 29 хромосом.
содержащий аллель ids1 – mum1 и 91 хромосому, содержащий ids1 – mum2 (данные не показаны). Не было обнаружено рекомбинантов между цветочным фенотипом и id1-mum -специфическими полиморфизмами ни для одного из аллелей.

Мы проанализировали фенотипы ids1 – mum растений после обратного скрещивания с A632 и самоопыления. Наиболее устойчивым фенотипом у мутантов ids1 – mum был дефект в колоске. Зрелые колоски кисточки дикого типа содержат два цветочка, каждый из которых состоит из трех тычинок.
и две лодикулы, заключенные в прицветники палеи и леммы (рис. B). Палеа отличается от леммы в силу того, что
его положение и тот факт, что он двухкилочный с двойной средней жилкой (Clifford and Watson 1977).Колоски кисточек ids1 – mum2 больше, чем у кистей дикого типа (Рис. A), так как присутствуют лишние соцветия (Рис. C). Номер
Количество цветков колеблется от минимум 3 на ids1 – mum1 растений до целых 10 на ids1 – mum2 растений. Помимо этих соцветий, между ними обычно можно увидеть тонкую рахиллу, содержащую несколько более мелких соцветий.
два самых верхних цветочка (рис. F). Эти более мелкие соцветия, как правило, постепенно уменьшаются, так что оставшиеся
кончик рахиллы едва заметен.Более крупные дополнительные соцветия показывают нормальный образец половой дифференциации и
имеют правильное количество тычинок и лодикул, окруженных палеей и леммой (рис. C).

Фенотипы у ids1 – мама мужских и женских колосков. ( A ) Обычный колосок с кисточкой A632 ( слева, ) и ids1 – mum2 с колосом с кисточкой ( справа, ).( B ) Рассеченный нормальный колоск кисточки A632, показывающий боковые органы верхних и нижних соцветий. ( C ) Расщепленный ids1 – mum2 колоск с кисточкой, показывающий четыре цветочка вместо двух. У каждого цветочка по три тычинки, окруженные палеой и леммой, как в A632.
( D ) Нормальный ушной колоск A632 ( левый ) и ids – mum1 ушной колоск ( правый ). Стрелки указывают на шелк. ( E ) Срединные продольные срезы неоплодотворенного 25-дневного ребенка ids1 – mum2 ушной колоск ( слева, ) и ушной колос A632 ( справа, ).Черные стрелки указывают на цветочки. Колоски А632 имеют одиночный цветочек с увеличенным нуцеллусом; ids1 – mum2 ушные колоски имеют по крайней мере три цветочка со значительно сниженным развитием боковых органов. ( F ) ids1 – mum2 колосок с удлиненной рахиллой, содержащей два цветочка. Одиночная стрелка указывает на кончик рахиллы.
(st) тычинки; (il) внутренняя лемма; (па) палеа; (ol) внешняя лемма; (ig) внутренняя чешуйка; (og) наружная чешуйка; (уф) верхний цветочек; (lf) ниже
цветочек; (ra) рахилла; (фл) цветочек.

Колоски самок ids1 – mum также имеют больший размер из-за наличия лишних цветков (рис. D, E). Колоски нормальные женские
содержат только один зрелый цветочек из-за аборта нижнего цветочка (Делонг и др., 1993). Развитие вторичных половых признаков у женских цветков включает в себя прерывание тычинок и развитие
гинецея, на примере образования длинных шелков, состоящих из двух сросшихся плодолистиков (Randolph 1936). ids1 – mum1 колоски самок часто содержат более одного шелка, расположенного в эктопических положениях (Рис. D). Эти шелка, однако, обычно
не развиваются нормально; они часто не сплавляются и не удлиняются до нужной длины. Если проявляющееся ухо вручную
После вскрытия и опыления развиваются несколько зерен, что позволяет предположить, что все другие аспекты оплодотворения и развития плодов
нормальный. При выращивании до зрелости эти ядра демонстрируют гомозиготные фенотипы ids1 – mum и, следовательно, не представляют собой изъятия из зародыша элементов Mu .Аллель ids1 – mum2 кажется более серьезным, поскольку большинство лишних цветков не могут развить полностью сформированные боковые органы (Рис. E, слева).
Приблизительно 5% из ids1 – mum2 женских колосков имеют удлиненную рахиллу, выходящую из колоска (Рис. F). В таких случаях можно заметить, что
рахилла не оканчивается верхним цветком, что еще раз подтверждает ее неопределенный характер. Нет очевидного и последовательного
фенотипы наблюдались в листьях и корнях мутантов ids1 , несмотря на то, что в этих органах экспрессируется ids1 .

Анализ с помощью растровой электронной микроскопии

Растровая электронная микроскопия использовалась для определения точки, в которой развитие меристемы колосков ids1 – mum отличается от такового у дикого типа. Меристема соцветия обычно инициирует пару колосков.
меристемы акропетально, которые, в свою очередь, разветвляются с образованием двух колосковых меристем (рис.А) (Ченг и др., 1983). Меристемы колосков также разветвляются, образуя нижние и верхние соцветия. Эти цветочки образуют необычный узор,
то есть, чередуя 180 градусов друг от друга (Рис. B). Хотя нижняя цветочная меристема инициирует сначала, боковой орган
В верхнем цветке развитие происходит значительно раньше, чем в нижнем (рис. C, D). Палеа — первый боковой орган
чтобы дифференцироваться, и вскоре после этого развиваются три тычинки (Cheng et al.1983). Половая дифференциация происходит на более поздних стадиях, на которых гинецей прерывается у мужских цветков, а тычинки — у самок.
цветочки (Dellaporta, Calderon-Urrea, 1993).

Сканирующая электронная микроскопия нормальных и ids1 – mum2 ушей. ( A ) A632 зачаток уха с инициирующими зачатками пары колосков и зачатками колосков.Пруток, 300 мкм. ( B ) A632 меристема неразветвленного колоска ( верх, ) и несколько более старая ветвистая меристема колосков ( низ ). Более старая меристема колосков подвергается боковому ветвлению, инициируя нижний цветочек. Бар, 102 мкм. ( C ) Развитие боковых органов у ушных колосков A632. В первую очередь развиваются боковые органы верхнего цветочка. Пруток, 80 мкм. ( D ) Созревающие боковые органы верхнего цветочка ушных колосков A632 с инициирующим гинецальным гребнем.Бар, 104 мкм. ( E ) Ветвление ids1 – mum2 меристемы колосков. Самая верхняя меристема колосков еще не разветвлена ​​и выглядит удлиненной. Одновременное ветвление цветков
зарождение леммы происходит на противоположных сторонах средней и нижней меристем колосков. Штанга, 156 мкм. ( F ) Дальнейшее развитие меристем колосков ids1 – mum2 с удаленными чешуйками, что свидетельствует о развитии цветочных меристем в пазухах нижних конечностей. Колоск
меристема сохраняется после каждого события ветвления.Пруток, 58 мкм. ( G ) Более старые ids1 – mum2 меристема колосков с удаленной чешуей. Остаточная меристема колосков удлиняется, образуя новый цветочек. Пруток, 60 мкм. ( H ) ids1 – mum2 колоск, показывающий созревающие боковые органы. Нет различия между верхним и нижним цветочками с точки зрения бокового органа.
разработка. Самый молодой цветочек, отходящий от меристемы колосков, не виден леммой. Бар, 171 мкм. (spm) Колоск
парная меристема; (см) колосковая меристема; (lfm) нижняя цветочная меристема; (gy) гинецей; (fm) цветочная меристема; (ле) лемма.

Мутанты ids1 – mum обнаруживают нормальное развитие до стадии, на которой меристема колосков начинает ветвиться. На этом этапе меристемы колосков ids1 – mum кажутся слегка удлиненными (Рис. E, вверху). В несколько более старых меристемах колосков (рис. E, в середине) два отчетливых
события ветвления можно увидеть по наличию двух лемм (стрелок).Затем в пазухах этих пазух образуются цветочные меристемы.
леммы (рис. E, внизу и F). Эти события ветвления происходят на противоположных сторонах меристемы колосков по двоякой схеме.
Меристема колосков сохраняется после каждого события ветвления и остается между двумя последними сформированными цветочками (рис. G, H). Этот
остаточная меристема колосков продолжает дистично инициировать дополнительные леммы и соцветия (рис. F, G). Скорость бокового органа
Развитие между первыми двумя цветочками ids1 – mum аналогично (рис.H), в отличие от дикого типа, у которого первыми развиваются органы верхнего цветочка.

Мы использовали ген гомеобокса узлов1 ( kn1 ) кукурузы, который экспрессируется в меристемах, а не в определенных боковых органах, чтобы проследить за событиями ветвления.
в ids1 — мама колосков. kn1 экспрессируется в меристемах колосков и цветков кукурузы (рис. A, B) (Jackson et al. 1994).Гибридизация с антисмысловым зондом kn1 на меристемах колосков ids1 – mum2 показала нормальную экспрессию в меристемах колосков (Рис. C). Однако, как только меристема колосков ids1 – mum2 разветвляется с образованием цветков, меристема колосков становится больше, и, следовательно, домен экспрессии kn1 расширяется (Рис. D). Сильная экспрессия kn1 наблюдается внутри дополнительных цветков, начинающихся от меристемы колосков на более поздних стадиях (рис.E, стрелки)
подтверждая меристематическое происхождение дополнительных цветков. Все другие аспекты экспрессии kn1 внутри цветков, включая отсутствие в боковых органах и слое L1, кажутся нормальными.

Локализация in situ kn1 в меристемах колосков A632 и ids1 – mum2 .( A ) Экспрессия kn1 внутри неразветвленной меристемы колоска A632. Пруток, 50 мкм. ( B ) Экспрессия kn1 внутри ветвящейся меристемы колоска A632. Выражение можно увидеть в зарождающемся нижнем цветочке. Пруток, 50 мкм.
( C ) Экспрессия kn1 в неразветвленной меристеме колосков ids1 – mum2 . Пруток, 50 мкм. ( D ) Экспрессия kn1 в пределах раннего ветвления ids1 – mum2 меристема колосков.По обе стороны от меристемы колосков видны зарождающиеся соцветия. Пруток, 60 мкм. ( E ) Экспрессия kn1 в более старом колоске ids1 – mum2 . Внутри развивающихся соцветий сохраняется сильное выражение. Пруток, 80 мкм. Стрелки указывают на зарождающиеся соцветия.
B, D, и E.

Анализ выражения

ids1

Первоначальная характеристика экспрессии ids1 с использованием гель-блоттинга РНК показала, что ген экспрессируется как в вегетативных, так и в цветочных тканях.РНК-гель
блоттинг с 3′-частью кДНК ids1 показывает, что транскрипт ids1 присутствует во всех протестированных тканях (рис. A). Наименьшее количество экспрессии наблюдалось в ткани эмбриона, а наибольшее
в ткани соцветия.

Анализ экспрессии ids1 в различных органах кукурузы B73.( A ) РНК-гель-блот, содержащий 1 мкг поли (A) + РНК, выделенную из эмбрионов через 17 дней после опыления ( E ), меристемы побегов, включая нерасширенный стебель и самые молодые зачатки листьев ( M ), колос примордии соцветий длиной до 2 см ( I ), первичные корни из семян, проросших во влажном воздухе ( R ), и лопаточная часть полностью развернувшихся молодых листьев ( L ) были промоканы и гибридизированы с 3 ‘частью. кДНК ids1 , которая не включает домен AP2.( B ) Контрольная гибридизация. Блот в A зондировали кДНК убиквитина кукурузы, чтобы показать относительную нагрузку.

Для определения уровней транскрипта ids1 у мутантов ids1 – mum , поли (A) + РНК была выделена из мутантных ушей и сравнена с РНК из ушей дикого типа. Как показано на рисунке А, транскрипт размера дикого типа отсутствует.
был обнаружен в аллеле ids1 – mum .Вместо этого наблюдались слабые транскрипты с более высокой молекулярной массой, которые могут быть результатом химерного или альтернативного
склеенные транскрипты. Этот результат демонстрирует, что вставки элемента Mu в ids1 не сплайсируются, и что оба ids1 – mum1 и ids1 – mum2 могут представлять аллели потери функции.

Анализ экспрессии ids1 в ушах мутанта ids1 – mum .( A ) РНК-гель, содержащий 1 мкг поли (A) + РНК, выделенную из 2-сантиметровых ушей из A632 ( 1 ), ids1 – mum2 ( 2 ) и ids1 – mum1 ( 3 ) подвергали блоттингу и гибридизовали с 3′-частью кДНК ID1 . ( B ) Контрольная гибридизация. Блот в A зондировали кДНК убиквитина кукурузы, чтобы показать относительную нагрузку.

Для более точной локализации временного и пространственного паттерна экспрессии ids1 мы использовали гибридизацию in situ.На рисунке А показаны продольные срезы вегетативного побега дикого типа.
apex зондировали меченной дигоксигенином антисмысловой РНК, полученной с 3′-конца клона ids1 . Положение листьев в побеге кукурузы было описано с помощью индекса пластохрона (Lamoreaux et al. 1978), в котором самый молодой лист обозначен как пластохрон 1 или P 1 , а последующие листья — как P 2 , P 3 и т. Д. Положение зарождающегося листа в меристеме обозначается как P 0 . ids1 Экспрессия обнаруживается на флангах меристемы в дискретной зоне (Рис. A). С позиции самого молодого листа
(обозначенный как P 1 ), мы предполагаем, что эта зона экспрессии меристемы находится в положении, в котором будет инициироваться следующий лист (обозначенный как P 0 ). Выражение также наблюдается в кончиках следующих двух более старых листьев, P 1 и P 2 .

Локализация in situ в вегетативных и цветочных верхушках B73 с использованием 3′-части кДНК ids1 .( A ) Апикальная меристема побега с молодыми зачатками листьев (P 1 и P 2 ) и зарождающимися зачатками листьев (P 0 ). Пруток, 65 мкм. ( B ) Молодое соцветие початка. ids1 Экспрессия может быть замечена в акропетально инициирующих зачатках пары колосков. Пруток, 70 мкм. ( C ) Колосковые неразветвленные меристемы. Выражение можно увидеть в меристеме колосков, но не в чешуях. Пруток, 36 мкм. ( D ) Ветвящиеся меристемы колосков. Сильное выражение можно увидеть во внутренней и внешней леммах, а также в зоне между
инициирующие верхние и нижние соцветия (стрелка без надписи).Эта зона экспрессии постепенно исчезает в более старом колоске.
ниже. В инициирующих цветочных меристемах экспрессии не обнаружено. Пруток, 70 мкм. ( E ) Цветочек верхний с зарождающимися тычинками. Дискретные области экспрессии ids1 могут наблюдаться в инициирующих зачатках тычинок и палеа. ids1 выражение сохраняется в расширяющихся внутренних и внешних леммах. Пруток, 70 мкм. ( F ) Более старый цветочек с лодикулами. Выражение тычинок теперь локализуется в камерах локул пыльника.Никакого выражения не может быть
замечено в лодикулах (ло). Пруток, 70 мкм. ( G ) ids1 – mum2 колоск, исследованный с помощью ids1. Мало или нет ids1 расшифровка не может быть обнаружена. Стрелки указывают на соцветия. Пруток, 130 мкм.

В продольных срезах ткани цветков экспрессия ids1 обнаруживается в нескольких различных зачатках боковых органов, а также в паре колосков и меристемах колосков.На рисунке B продольные срезы меристем ранних соцветий, исследованные с помощью ids1 , показывают полосы экспрессии в повторяющемся паттерне, который, очевидно, соответствует зачаткам пары колосков. На более позднем этапе
после образования ножек и сидячих колосков экспрессия ids1 обнаруживается по всей меристеме колосков, но не в первых двух зачатках боковых органов, образованных из колоска.
меристема, внешняя и внутренняя чешуйки (рис.C). Вскоре после зарождения цветковых меристем (рис. D) экспрессия ids1 присутствует в инициирующих внутренних и внешних листьях прицветника леммы, прилегающих к цветкам, но отсутствует в зародыше.
Сама цветочная меристема. Кроме того, видна сильная полоса экспрессии в области между верхними и нижними цветочками.
(Рис. D, стрелка без надписи). У немного более старых колосков, как показано в нижней части рисунка D, эта полоса экспрессии начинается
исчезнуть.Микрофотография колосков на эквивалентных стадиях, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа, показана на рисунке В. В более зрелой кисточке.
соцветия (рис. E), дискретные группы клеток меристемы цветков, которые образуют тычинки, а палеа экспрессирует
идентификаторов1. Экспрессия сохраняется на более поздних стадиях в более старых расширенных палеа и лемма, а также в камерах локул пыльника (рис.
F). В жёлтях или гинеце уха экспрессия была незначительной или отсутствовала (рис.F; данные не показаны). Как показано на рисунке G,
когда зонд anti-sense ids1 используется на колосках ids1 – mum , экспрессия ids1 не обнаруживается.

Обсуждение

Регулирование количества цветков, инициированных меристемой колосков, является важным шагом в определении морфологии колосков.Мутации в гене ids1 влияют на детерминированность меристемы колосков. Вместо того, чтобы давать только верхний и нижний соцветия, меристема колосков ids1 – mum продолжает инициировать дополнительные соцветия в двухсторонней филлотаксии. Понимание того, как ids1 способствует определению меристемы колосков, требует изучения различных моделей инициации цветков кукурузы.

Одна модель зарождения цветков предполагает, что нижний цветочек начинается латерально, тогда как верхний цветочек — терминальный,
в результате превращения меристемы колосков в верхний цветочек (рис.A) (Ирландский язык, 1997 г.). У некоторых видов трав, таких как anthoxanthum, , колоск заканчивается цветком, а семяпочка является конечной структурой (Clifford 1987). Если верхний цветочек является терминальной структурой в нормальном развитии кукурузы, белок IDS1 может действовать, способствуя трансформации.
меристемы колосков в верхний цветочек. IDS1 может делать это самостоятельно или посредством активации идентичности цветочной меристемы.
гены, такие как ортологи LEAFY и APETELA1 , которые могут преобразовывать меристемы соцветий в цветочные меристемы (Mandel and Yanofsky 1995; Weigel and Nilsson 1995).Если бы это было так, мы бы предположили, что трансформация меристемы колосков в меристему цветков задерживается у мутантов ids1 – mum , позволяя меристеме колосков сохраняться и инициировать больше цветков. Такое толкование использовалось
объясняют фенотип доминантных мутантов Ts6 кукурузы, у которых образуются лишние соцветия (Irish 1997). Мутанты Ts6 отличаются от мутантов ids1 – mum , однако, тем, что они также влияют на определение пола и вызывают отсутствие подавления карпеля в кисточке,
но не в ухо.

Модели для инициации цветков кукурузы. ( A ) Терминальный верхний цветочек. Колосковая меристема разветвляется один раз латерально, образуя нижний цветочек. Остаточный колоск
меристема (показанная черным) затем трансформируется в верхний цветочек (черный). ( B ) Модель с боковым разветвлением.Меристема колосков имеет боковое ветвление, образуя нижние, а затем верхние соцветия. В
остаточная меристема колосков (показана черным) находится в небольшой области между цветками. Зачаток колоска
меристема находится в рахилле в зрелом колоске (черный).

Альтернативная модель предполагает, что и верхние, и нижние соцветия являются латеральными продуктами меристемы колосков.Два
соцветия кукурузы интерпретируются как боковые ветви рахиллы с небольшим остатком оси или без остатка оси между ними
цветочки (Bonnett 1953). Если ветвление верхнего цветочка латеральное, то в рахилле может быть обнаружен сильно редуцированный зачаток меристемы колосков.
после зарождения верхнего цветочка (рис. Б). Согласно этой модели IDS1 будет участвовать в подавлении неопределенного роста.
внутри меристемы колосков, что препятствует регенерации меристемы колосков после ветвления верхнего цветочка.У мутантов ids – mum остаточная меристема колосков размножается и продолжает образовывать соцветия.

На основе паттерна экспрессии ids1 и времени появления дефектов ids1 – mum , мы отдаем предпочтение второй модели и предполагаем, что функция IDS1 подавляет неопределенный рост в колоске.
меристема. Согласно первой модели, переключение судьбы меристемы колосков происходит только после инициирования нижнего цветочка.Однако дефекты в меристемах колосков ids1 – mum впервые наблюдались в меристемах колосков до зарождения нижних цветков (Рис. E). Сроки
дефект указывает на то, что изменение в детерминации судьбы происходит раньше, в соответствии с экспрессией ids1 , наблюдаемой в меристеме колосков до того, как происходит ветвление цветков (Fig. C). Первая модель также предполагает, что
вся меристема колосков превращается в верхний цветочек, не оставляя остаточной меристемы колосков.Тем не менее, экспрессия ids1 была обнаружена в зоне между верхними и нижними соцветиями у дикого типа (рис. D), в которой остаточный колоск
ожидается, что меристема будет локализована. Дополнительное свидетельство того, что эта область представляет собой остаточную меристему колосков, появляется.
из наблюдения, что он регенерирует после ветвления цветков у мутантов ids1 – mum (Рис. F, G). Более того, ожидание от первой модели состоит в том, что ids1 будет выражаться по всему верхнему цветку будущего, чтобы способствовать его преобразованию в цветочную идентичность.Вместо этого, как показано
на рисунке D мы не видим экспрессии ids1 ни в верхней, ни в нижней цветочной меристеме. Наконец, если бы детерминированность меристемы колосков просто была
задержка у мутантов ids1 – mum в соответствии с первой моделью, можно было бы ожидать, что рахилла в конечном итоге оканчивается цветком. Это было
не наблюдается ни у самцов, ни у самцов ids1 – mum колосков (рис. F; данные не показаны).

Считается, что развитие критического размера меристемы у кукурузы дает сигнал к возникновению ветвления (Sundberg and Orr 1996). Одним из механизмов, с помощью которого IDS1 может подавлять неопределенный рост, является ограничение размера остаточной меристемы колосков.
такой, что он больше не может начинать соцветия. У мутантов ids1 – mum размер остаточной меристемы колосков может быть нарушен и увеличиваться до большего, чем обычно.Колоск большего размера
меристема потенциально может позволить большему количеству событий ветвления произвести дополнительные соцветия. В поддержку этой идеи
ids1 – mum меристема колосков кажется более удлиненной, чем обычно, до образования цветков (Рис. E). Также более крупная меристема колосков
диаметр наблюдается вскоре после зарождения первого цветочка у мутантов ids1 – mum (Рис. D).

Однако важно понимать, что судьба меристемы не всегда зависит от размера меристемы.Например, верхний
Цветочная меристема намного больше, чем нижняя цветочная меристема во время инициации (Рис. B), и тем не менее обе они одинаково
решил сделать цветочки. Таким образом, наличие более крупной меристемы колосков не обязательно наделяет ее большей неопределенностью.
Не менее важным компонентом различия между определенными и неопределенными судьбами меристемы колосков является способность
регенерировать после зарождения цветков.Меристемы с неопределенной судьбой могут проявлять большую способность к самовосстановлению.
независимо от их первоначального размера. Измененная морфология, наблюдаемая в меристемах колосков у мутантов ids1 – mum , может быть просто отражением этой способности.

Возможно, что одним из способов, которым IDS1 функционирует для поддержания детерминированности меристемы колосков, является подавление этих необходимых факторов.
для сохранения неопределенности.Ген гомеобокса kn1 экспрессируется в нескольких типах неопределенных меристематических тканей, но не в определенных органах, таких как листья.
(Смит и др., 1992; Джексон и др., 1994). Мутанты с потерей функции kn1 кукурузы демонстрируют пониженное ветвление метелки и меньшее количество колосков. Постулировалось, что этот фенотип является результатом потери неопределенного
клетки соцветия, которые в отсутствие kn1, приняли определенную судьбу (Kerstetter et al.1997). Если kn1 фактически поддерживает неопределенность меристемы, то экспрессия kn1 должна сохраняться в пределах меристемы колосков ids1 – mum и демонстрировать расширенный домен. Хотя это наблюдалось (Fig. D), важно отметить, что kn1 обычно экспрессируется как в колосковой, так и в цветочной меристеме (Fig. A, B). Таким образом, тот факт, что домен экспрессии kn1 расширяется у мутантов ids1 – mum , может просто отражать дополнительные области инициации цветков.

Ген ids1 был клонирован по гомологии с геном AP2 из Arabidopsis , и было показано, что он содержит два повтора высококонсервативного домена AP2. Хотя белок IDS1 показывает большее сходство с
AP2 по сравнению со всеми другими AP2 -подобными генами, клонированными до сих пор, ген ids1 может не представлять фактический ортолог AP2 кукурузы.Гомология аминокислот между IDS1 и AP2 не распространяется за пределы домена AP2. Кроме того,
Экспрессия ids1 не была обнаружена в плодолистых, как обнаружено для AP2 (Jofuku et al. 1994). Наконец, предварительные эксперименты показывают, что сверхэкспрессия кДНК ids1 в Arabidopsis не дополняет мутантный фенотип ap2-1 (G. Chuck unpubl.). Дополнительные члены семейства AP2 , вероятно, будут присутствовать в геноме кукурузы, поскольку гибридизации с низкой строгостью с доменом ids1 AP2 в качестве зонда на саузерн-блотах кукурузы показывают несколько полос гибридизации (данные не показаны).Кроме того, несколько выраженных
Было показано, что теги последовательностей из библиотек кДНК кукурузы содержат домены AP2 (Klucher et al. 1996).

Хотя ids1 экспрессируется в зачатках вегетативных и цветочных боковых органов, явных мутантных фенотипов в этих органах обнаружено не было.
В этих органах может действовать определенный уровень генетической избыточности, который может быть обнаружен только путем анализа двойного
мутанты.Например, двойные мутанты ap2 и aintegumenta обнаруживают фенотипы цветочных органов, не наблюдаемые ни у одного единственного мутанта Arabidopsis (Elliot et al. 1996). Учитывая большое количество AP2 -подобных генов, присутствующих в геноме Arabidopsis (Okamuro et al. 1997), было бы неудивительно обнаружить такую ​​функциональную избыточность, имеющую место у кукурузы. Недавно было высказано предположение, что
два тесно связанных гена MADS-бокса, zag1, и zmm2, , играют избыточную роль в определении идентичности плодолистиков и тычинок кукурузы (Mena et al.1996).

Хотя органы цветков ID1 – мама соцветий кисточки полностью функциональны и напоминают органы цветков дикого типа, дефекты органов цветков наблюдались у самок ID1 – мама . Возможное объяснение этого дефекта может заключаться в том, что у нормальной самки происходит прерывание нижнего цветочка.
колоски. Если различие между верхними и нижними соцветиями утрачено у мутантов ids1 – mum , то все соцветия могут получить сигнал об прерывании беременности, который обычно присутствует только в нижних цветках дикого типа.Для проверки этой модели будет полезен анализ двойных мутантов с использованием мутанта с метелкой 2 , у которого не происходит выкидыша нижних цветков (DeLong et al. 1993).

В свете того факта, что многие представители семейства злаковых обладают неопределенными колосками, есть соблазн предположить, что AP2 -подобные гены играют роль в регулировании количества цветков у других трав. Колоски с множеством цветков считаются древним
Этот признак, учитывая, что производные виды почти повсеместно эволюционировали, уменьшили количество цветков (Стеббинс, 1987).Возможный механизм такого снижения может включать изменение функции или домена экспрессии гена ids1 , чтобы включить меристему колосков в дополнение к различным латеральным органам, где она обычно экспрессируется. Анализ
экспрессии ids1 как в современных, так и в древних травах будет интересно проанализировать в этом отношении.

Материалы и методы

Клонирование гена

ids1

Сорок тысяч бляшек библиотеки кДНК B73, построенных из ушей соцветий размером от 1 до 3 см (Jackson et al.1994) были исследованы при пониженной строгости при 55 ° C в 50% формамиде (Schmidt et al. 1993) с полноразмерной кДНК AP2 из Arabidopsis (Jofuku et al. 1994). Было выделено примерно 75 положительных клонов. Далее был проанализирован только самый сильный гибридизирующий класс. Представитель
клон из этого класса был использован для исследования библиотеки кДНК вегетативной меристемы B73 (Lambda ZapII, Stratagene), из которой полноразмерный
Была выделена кДНК размером 1,9 т.п.н. КДНК была субклонирована в pSK- и обе цепи секвенировали с помощью секвенатора ABI.Анализ последовательности
было сделано с использованием GCG (Wisconsin Genetics Group) и сервера E-MAIL Национального центра биотехнологии.

Гель-блоты РНК и гибридизация in situ

РНК

выделяли из зародышей, ушей, вегетативных меристем и корней, как описано ранее (Kerstetter et al. 1994). Гибридизацию in situ проводили, как описано Jackson et al.(1994) с использованием 3′-концевого зонда между нуклеотидами 1330 и 1835 вне консервативного домена AP2 . Этот же фрагмент ДНК использовали для зондирования всех гель-блотов РНК. Наблюдается единственная полоса, гибридизирующаяся с этим зондом
на гель-блотах ДНК (данные не показаны), поэтому перекрестная гибридизация с другими членами семейства AP2 маловероятна.

Выделение рецессивных аллелей

ids1 методом ПЦР

Приблизительно 42000 растений F . 1 растений от скрещиваний между запасами, содержащими активные мобильных элементов Mu , выращивали и подвергали скринингу с помощью ПЦР в Pioneer Hi-Bred International для вставки в ID1 (Bensen et al.1995) с праймером ZAP2-1 (5′-CCGGTGGCGCCAGCGAAGAA-3 ‘) и Mu-9242 (5′-CCCTGAGCTCTTCGTC (CT) ATAATGGCAATTATCTC-3’), вырожденный
праймер, который связывается с концевым инвертированным повтором Mu. Реакции ПЦР проводили на гелях, блотировали и зондировали с помощью кДНК ID1 и . Продукты ПЦР, которые гибридизуются с кДНК ids1 , идентифицировали людей, которые, вероятно, имеют вставки Mu в ген ids1 . Такой скрининг идентифицировал девять кандидатов с использованием праймера ZAP2-1.ДНК-гель-блот-анализ расщепленной ДНК, полученной из
самоопыляемое потомство каждого кандидата выявило полиморфизм только для двух из девяти семейств при зондировании с помощью кДНК ids1 . Эти же два семейства были единственными, которые генерировали продукты ПЦР ids1 с использованием праймеров ZAP2-1 и Mu 9242. Вероятно, что семь других семейств, которые не показали полиморфизмов
представляют собой события соматической вставки Mu в id1 , которые не передались в зародышевую линию.Каждый аллель ids1 – mum был получен от скрещивания активной линии Mu и инбредной линии A632. Оба аллеля были однократно скрещены с A632 и подверглись самоопылению для наблюдения фенотипов.
у гомозигот. Фенотипы также наблюдались после второго обратного скрещивания с A632 и обратного скрещивания с инбредным W23.

Сканирующая электронная микроскопия

Ткань фиксировали в FAA (50% этанол, 5% уксусная кислота, 3.7% формальдегида) при 4 ° C в течение ночи и обезвоживание в этаноле
серию до 100%. Затем образцы были высушены до критической точки и напылены палладием. Образцы были просмотрены на ISI
30 РЭМ при ускоряющем напряжении 10 кВ.

Благодарности

Благодарим Дж. Окамуро и Д.Джофуку (Калифорнийский университет, Санта-Крус) за дар кДНК AP2 , Р. Керстеттеру за использование его РНК-блоттинга и К. Канаде (Pioneer Hi-Bred International) за идентификацию вставок ids1 . Мы также признательны Э. Фольбрехту, П. Макстину, Л. Райзеру, Ф. Хемпелю и сотрудникам лаборатории Хека.
за рецензирование рукописи и полезные обсуждения. G.C. был поддержан стипендией Калифорнийского университета.
Работа поддержана Институтом У.S. Департамента сельского хозяйства и частично выполняются в рамках Совместных исследований и разработок.
Соглашение с Pioneer Hi-Bred International, Inc.

Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Поэтому эта статья должна быть настоящим
помечены как «реклама» в соответствии с разделом 1734 Кодекса США 18 исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

Для судьбы колосков в соцветиях брахиподиума требуется еще

колосков1

  • © Американское общество биологов растений, 2013.Все права защищены.

Abstract

Травы производят соцветия на структуре, называемой колоском, а разнообразие в количестве и расположении как ветвей, так и колосков способствует большому разнообразию архитектуры соцветий травы. У Brachypodium ( Brachypodium distachyon ) соцветие представляет собой неразветвленный колос с верхним колоском и ограниченным количеством боковых колосков. Колоски индетерминантные и дают различное количество цветков.Здесь мы приводим подробное описание этапов развития соцветий у Brachypodium. Чтобы получить представление о генетической регуляции развития соцветий Brachypodium, мы создали популяции мутантов с быстрыми нейтронами и проверили фенотипические мутанты. Среди идентифицированных мутантов мутант с более чем колосками1 ( mos1 ) имел повышенное количество пазушных меристем, продуцируемых из меристемы соцветий, по сравнению с диким типом. Эти пазушные меристемы развивались как ветви с образованием колосков более высокого порядка.Используя подход генов-кандидатов, было обнаружено, что mos1 имеет геномную перестройку, нарушающую экспрессию фактора транскрипции APETALA2 класса фактора ответа этилена, связанного с генами идентичности меристемы колосков mays ) и FRIZZY PANICLE ( FZP ) в рисе ( Oryza sativa ). Мы предполагаем, что MOS1 , вероятно, соответствует ортологу Brachypodium bd1 и FZP , и что функция этого гена в определении судьбы меристемы колосков сохраняется у отдаленно родственных видов трав.Однако MOS1 также, по-видимому, участвует во времени инициации терминального колоска. Таким образом, MOS1 может регулировать переход к развитию терминальных колосков у других близкородственных и важных с точки зрения сельского хозяйства видов, особенно пшеницы ( Triticum aestivum ).

Побеги растений развиваются из апикальной меристемы побегов, которая включает центральную область плюрипотентных клеток и периферическую область, где клетки рекрутируются для формирования боковых органов.Апикальная меристема побега закладывается на ранних этапах эмбриогенеза и дает начало всем надземным частям растения. После репродуктивного перехода апикальная меристема побега превращается в меристему соцветия, которая может производить пазушные меристемы, образующие ветви и цветы. Производство, расположение и судьба меристем определяют архитектуру соцветий.

Архитектура соцветий растений очень разнообразна, и одно из наиболее ярких отражений этого разнообразия — в основных видах зерновых культур.У кукурузы ( Zea mays ) кисточка и колосовое соцветие неопределенные. Пазушные меристемы, образованные соцветием в кисточке, изначально представляют собой недетерминантные ветви. И кисточка, и колосовое соцветие, а также ветви кисточки образуют меристемы пары колосков, которые затем образуют определенные меристемы колосков, которые заканчиваются образованием двух цветков или соцветий (Bortiri and Hake, 2007; Kellogg, 2007). В соцветии или метелке риса ( Oryza sativa ) меристемы ветвей первоначально образуют вторичные меристемы ветвей.Как первичные, так и вторичные ветви образуют боковые меристемы колосков и терминальные меристемы колосков. Колосковая меристема дает единственную цветочную меристему и единственный цветочек (Bommert et al., 2005; Wang, Li, 2008). Для сравнения: соцветие или колос ячменя ( Hordeum vulgare ) и пшеницы ( Triticum aestivum ) без ветвей (Bonnett, 1935, 1936). У ячменя меристема соцветия неопределенная и дает боковые меристемы колосков, образующие три соцветия.У пшеницы меристема соцветия является детерминированной и дает ограниченное количество боковых меристем колосков и конечную меристему колосков, при этом каждая меристема колосков дает несколько цветков.

Гены, необходимые для развития соцветий, были идентифицированы посредством анализа мутантов кукурузы и риса, и многие из этих генов контролируют инициацию и судьбу меристемы (Bommert et al., 2005; Sreenivasulu and Schnurbusch, 2012). Одна группа мутантов не может давать ветки и колоски. бесплодный стебель1 ( ba1 ) у кукурузы приводит к радикальному снижению продукции пазушных меристем и образует неразветвленное соцветие без колосков (Ritter et al., 2002; Gallavotti et al., 2004). Мутация в LAX PANICLE1 ( LAX1 ), ортологе риса ba1 , также приводит к меньшему количеству колосков (Komatsu et al., 2001, 2003b). Ген риса MONOCULM1 ( MOC1 ) (также известный как SMALL PANICLE ) необходим для инициации подмышечных меристем на протяжении вегетативного и репродуктивного развития. moc1 мутанты лишены побегов и имеют мало ветвей и колосков соцветий (Li et al., 2003; Oikawa, Kyozuka, 2009). бесплодное соцветие2 ( bif2 ) кукурузы не дает ветвей или колосков в соцветии и требуется для поддержания всех типов пазушных меристем (McSteen and Hake, 2001). ba1 , LAX1 и MOC1 кодируют факторы транскрипции, тогда как bif2 кодирует белок протеинкиназы Ser / Thr, участвующий в передаче сигналов ауксина (Komatsu et al., 2003b; Ли и др., 2003; Галлавотти и др., 2004; McSteen et al., 2007).

Другая группа мутантов кукурузы и риса усиливает ветвление соцветий. Мутанты кукурузы ramosa1 ( ra1 ), ra2 и ra3 меняют меристемы из пары колосков на меристемы ветвей, что приводит к появлению большего количества ветвей в кисточке и развитию ветвей в колосе (Vollbrecht et al., 2005; Bortiri et al., 2006; Satoh-Nagasawa et al., 2006). Аналогичным образом, мутанты в семействе ортологичного фактора этиленового ответа (ERF) генов фактора транскрипции APETALA2 (AP2) разветвленного без шелка1 ( bd1 ) у кукурузы и FRIZZY PANICLE ( FZP ) у риса приводят к образованию сильно разветвленных соцветий из-за к превращению меристем колосков в меристемы ветвей (Colombo et al., 1998; Чак и др., 2002; Komatsu et al., 2003a; Чжу и др., 2003; Йи и др., 2005).

Хотя многие гены архитектуры соцветий были идентифицированы у видов трав с разветвленными соцветиями, гораздо меньше известно о факторах, регулирующих развитие неразветвленных соцветий (Malcomber et al., 2006). В неразветвленном соцветии, известном как колос, пазушные меристемы, образованные меристемой соцветия, развиваются непосредственно в колоски. Как и у пшеницы и ячменя, соцветие Brachypodium ( Brachypodium distachyon ) представляет собой колос (Draper et al., 2001; Vogel et al., 2006). Чтобы понять регуляцию развития колючек, мы провели исследование стадий развития колосков Brachypodium. Здесь мы представляем подробный анализ онтогенеза соцветия, поскольку он связан с развитием меристемы у Brachypodium дикого типа (номер доступа Bd21). Кроме того, чтобы начать изучение генетической регуляции архитектуры соцветий Brachypodium, мы создали условия для быстрых нейтронов Brachypodium и химического мутагенеза. Популяции мутантов быстрых нейтронов имели высокую частоту мутантов, и из этих популяций мы идентифицировали ряд мутантов.Три мутанта по соцветию: awnless1 ( awl1 ), без соцветия1 ( nif1 ) и less1 ( til1 ), имели дефектное развитие колосков и / или цветков, а у одного мутанта еще колосков1 ( мос1 ), колоски переделаны в ветви. Мы показываем, что дефект соцветия mos1 является результатом изменений судьбы меристемы колосков во время развития соцветия. Наконец, мы показываем, что mos1 , вероятно, соответствует мутации в гене Brachypodium, наиболее тесно связанной с кукурузой bd1 и рисом FZP .Таким образом, bd1 , FZP и MOS1 обладают консервативной функцией, чтобы способствовать детерминированной судьбе меристемы колосков в травах. Однако MOS1 в Brachypodium, по-видимому, участвует в инициации терминального колоска и, таким образом, может контролировать количество колосков, образующихся в неразветвленном детерминированном колоске.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Развитие соцветий Brachypodium

Чтобы заложить основу для описания развития соцветий Brachypodium, мы провели детальный анализ онтогенеза соцветий дикого типа.После прорастания первый настоящий лист был виден через 6 дней после посева, а шесть-семь дополнительных листьев сформировались до появления меристемы соцветия, примерно через 22 дня после посева (рис. 1A). Пазушные меристемы у основания растения удлинялись, образуя несколько базальных стеблей, которые были похожи на основной стебель (стебель; рис. 1А). Степень образования побегов варьировалась в зависимости от условий произрастания. При более низкой освещенности образовалось больше побегов, и в этих условиях переход к цветению задерживался.

Рисунок 1.

Развитие соцветий Brachypodium. А. Целые растения через 6, 10, 14, 18, 22 и 26 дней после посева (дас). От B до E: продольные срезы верхушки побега растений через 6 дней (B), 10 дней (C), 14 дней (D), 18 дней (E). am, подмышечная меристема; fm — цветочная меристема; ls — боковой колоск; sam — апикальная меристема побега; см — меристема колосков; ц, концевой колоск. Полосы = 2 см (A) и 100 мкм (B – E). [Цветную версию рисунка см. В статье в Интернете.]

Соцветие Brachypodium состояло из двух или трех боковых колосков и концевого колоска (рис.2А). Каждый колоск состоял из двух базальных чешуек и в среднем из 11 цветков, расположенных двояковыпуклой филлотаксией вдоль центрального стержня (рис. 2В; таблица I). Как и при выращивании культиватора, количество колосков и цветков, а также набор семян зависели от условий роста. При менее чем оптимальных условиях роста плодовитость была низкой, и в этом случае колос давал больше цветков. Цветки состояли из внешней остистой леммы, полупрозрачной палеи, двух лодикул, трех тычинок и центрального пестика (рис.2, В и Г). Две боковые тычинки созрели и дали пыльцу, тогда как абаксиальные тычинки остались рудиментарными и стерильными.

Рисунок 2.

Развитие колосков и цветков Brachypodium. А, соцветие дикого типа с концевыми и боковыми колосками. B, Терминальный колоск. C, Флоре показывает палею (слева) и лемму с дистальной остью (справа). D, СЭМ репродуктивных органов цветков. Палеа была удалена, чтобы обнажить два развитых пыльника и пестик. E, Ранняя голая стадия развития соцветия с зарождающейся цветочной меристемой терминальных и боковых колосков.F, стадия инициации ости, когда рост цветковых органов в терминальном колоске более развит у базальных цветков по сравнению с апикальными цветками. G, закрытая стадия терминального колоска с наружной чешуей терминального колоска, окружающего развивающиеся соцветия. H, гибридизация in situ экспрессии BdKN1 в колоске. I. Филограмма максимального правдоподобия белков KNOX класса I Brachypodium, риса и кукурузы. Значения начальной загрузки максимального правдоподобия указаны на ветвях. а, Awn; ан, пыльник; ф, цветочек; fm — цветочная меристема; gl, чешуйка; lgl, нижняя чешуя; ls — боковой колоск; l, лемма; п — пестик; ts, терминальный колоск; цм — терминальная меристема колосков; угл, верхняя чешуя.Штанги = 100 мкм. [Цветную версию этого рисунка см. В статье в Интернете.]

Таблица I. Число колосков и цветков в колосе Brachypodium

Чтобы определить время перехода от вегетативного к репродуктивному периоду, мы подготовили продольные срезы верхушек растений и исследовали морфологию побегов апекс от 6-, 10-, 14- и 18-дневных растений, выращенных в условиях длинного дня. У 6-дневных растений апикальная меристема побега представляла собой короткий купол клеток, по бокам которого развивались зачатки листьев (рис.1Б). У 10-дневных растений апикальная меристема была более удлиненной, чем у 6-дневных растений, и начинался концевой колоск (рис. 1С). Таким образом, переход к репродуктивной судьбе происходил у растений возрастом от 7 до 9 дней. Цветочные меристемы терминального колоска проявлялись на верхушках 10-, 14- и 18-дневных растений на продольных срезах, тогда как боковые колоски с явными цветочными меристемами были заметны только на более поздней стадии у 18-дневных растений ( Рис.1, D и E). Следовательно, развитие терминального колоска предшествует развитию боковых колосков.

Чтобы охарактеризовать более поздние стадии развития соцветий Brachypodium, мы вскрыли верхушки 17–22-дневных растений и исследовали развитие ранних соцветий с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Меристема соцветия образовывала боковые колоски в виде дистихической филлотаксии, тогда как концевой колоск был ориентирован под углом 90 ° к плоскости боковых колосков (рис. 2E). В соответствии с результатами продольных срезов, анализ SEM показал, что развитие терминального колоска было более развитым, чем развитие боковых колосков (рис.2, E – G). Таким образом, развитие соцветия легче всего проследить путем осмотра терминального колоска. На самой ранней исследованной стадии развития соцветия терминальные колоски инициировали несколько цветочных меристем (рис. 2E). Инициирование самого внешнего цветочного органа, леммы, было очевидным как гребень клеток в основании цветочных меристем, тогда как другие цветочные органы не были очевидны. Две чешуи, связанные с верхним колоском, также образовались, причем верхняя чешуйка более заметна, а нижняя чешуя представлена ​​только в виде небольшого гребня ткани.Мы назвали это «голой» стадией развития соцветия, так как цветочные меристемы терминального колоска были полностью обнажены. Следующая стадия развития наступила, когда зародились несколько цветков терминального колоска и характеризовалась ростом чешуек и нижних соцветий базальных соцветий (рис. 2F). Развивающаяся лемма вытянулась и дифференциальный рост дистальной средней области леммы привел к образованию ости. Мы классифицировали это как стадию «инициации ости». Впоследствии верхняя чешуйка и самый базальный цветочек удлинились, чтобы покрыть терминальный колоск, и это произошло до удлинения латеральных чешуек колосков (рис.2G; Дополнительный рис. S1). Мы назвали это стадией «закрытого концевого колоска».

Как в терминальных, так и в боковых колосках цветочные меристемы развивались акропетально (Рис. 2F). Чтобы подтвердить прогрессирование развития меристемы цветков в терминальном колоске и установить информативный молекулярный маркер для развития меристемы соцветий, мы использовали последовательность всего генома для идентификации генов Brachypodium, кодирующих факторы транскрипции KNOX I класса. -узловые гомеобоксы класса I (KNOX) необходимы для функции меристемы побегов, экспрессируются в меристемах побегов и подавляются в боковых органах (Jackson et al., 1994; Long et al., 1996; Sentoku et al., 1999). Brachypodium имеет семь генов KNOX класса I (Vogel et al., 2010). Филогенетический анализ с максимальной вероятностью белков KNOX класса I Brachypodium, кукурузы и риса показал, что Brachypodium кодирует один ортолог в каждой кладе гена KNOX класса I, за исключением клады knox3, где ген Brachypodium отсутствует, и клады knox10, где есть два гена, Bradi1g12677 и Bradi1g12690 , которые расположены рядом друг с другом на хромосоме 1 (рис.2I). По сравнению с другими генами KNOX класса I, Bradi1g12677 усечен и может быть псевдогеном.

Белок, кодируемый Bradi1g10047, был наиболее тесно связан с KNOTTED1 (KN1) кукурузы и риса HOMEOBOX1 (OSh2; рис. 2I). Поэтому Bradi1g10047 получил обозначение BdKN1 . Мы использовали гибридизацию in situ для изучения паттерна экспрессии BdKN1 в развивающемся терминальном колоске Brachypodium дикого типа и обнаружили, что он высоко экспрессируется в меристемах колосков и цветков.(Рис. 2H). Подобно kn1 , экспрессия BdKN1 не была обнаружена во внешнем слое клеток L1 всех меристем побегов. BdKN1 подавляется в небольшой области, смежной с терминальной меристемой колосков, которая соответствует участку инициирующего органа. От вершины к основанию колоска цветочные меристемы становились все больше и больше, и BdKN1 подавлялся в развивающихся органах, связанных с этими меристемами. Таким образом, паттерн экспрессии BdKN1 совпадает с паттерном экспрессии близкородственных генов у других растений и маркирует активные меристемы у Brachypodium.Характер экспрессии также подтверждает акропетальное созревание цветков колосков.

Мутагенез Brachypodium

Чтобы идентифицировать гены, регулирующие развитие соцветий у Brachypodium, мы создали мутагенизированные популяции, которые были проверены на наличие мутантов по развитию соцветий. Мы использовали два подхода к мутагенезу, химический мутагенез этилметансульфоната (EMS) и облучение быстрыми нейтронами, которые оказались успешными в создании мутантов у других видов. Мутанты были получены с использованием обоих подходов (дополнительный рис.S2). Популяции, подвергшиеся мутагенезу быстрыми нейтронами, давали более частые мутанты и поэтому стали предметом последующего скрининга.

Два испытания мутагенеза на быстрых нейтронах продемонстрировали, что воздействия от 20 до 30 Грея (Гр) было достаточно для получения растений, которые дают жизнеспособные семена (дополнительный рис. S2, A и B). Используя эти две независимые популяции мутантов с быстрыми нейтронами, мы провели скрининг потомства M2 из 872 линий M1 на наличие видимых фенотипов побегов. Мутанты были разделены на три основные категории: альбиносы, бледные и с дефектами развития (дополнительные рис.S2, C, D и S3). В двух популяциях мутантов было 5% линий, разделяющих мутантов-альбиносов, и 4% линий, разделяющих бледных мутантов (дополнительный рисунок S3A). Класс дефектного развития мутантов включает фенотипы, нарушающие развитие побегов растений, и эти мутанты были идентифицированы в 2% и 4% линий в двух популяциях мутантов. Онтогенетические мутанты включали растения, которые были чрезвычайно карликовыми мутантами, мутант с морщинистым листом и мутант с нисходящим ростом (дополнительный рис. S3, B – D).Частота мутантных фенотипов, особенно высокая частота мутантов-альбиносов в линиях быстрых нейтронов, указывает на то, что доза от 20 до 30 Гр эффективна для мутагенеза Brachypodium.

Три мутанта: awl1 , nif1 и til1 нарушили развитие соцветий. awl1 был подобен дикому типу во время вегетативного развития; однако при репродуктивном развитии цветковая лемма не образовывала ости, а развитие пестика было аномальным (рис.3, А – Д). nif1 также был сходен с диким типом во время вегетативного развития; однако при переходе к развитию соцветий nif1 часто не образовывал колосков и вместо этого давал голый стебель (рис. 3, F и H). Мутант til1 был нарушен как в вегетативном развитии, так и в развитии соцветий. У дикого типа побеги возникают в пазухах листьев у основания растения, тогда как у мутанта til1 побеги отсутствуют (рис. 3G).В соцветии от до 1 конечный колоск и боковые колоски имели дефектные и уменьшенное количество соцветий (рис. 3, G и I). Четвертый мутант, mos1 , также повлиял на развитие соцветий и произвел больше колосков, чем дикий тип. Этот мутант был выбран для дальнейшего анализа.

Рисунок 3.

Мутанты по соцветию. A, awl1 цветковое растение. B и C, Spike дикого типа (B) и awl1 (C). D и E, Репродуктивные органы дикого типа (D) и awl1 (E).Пыльники отмечены стрелками. F и G, цветковое растение nif1 (F) и til1 (G). H и I, шипы в nif1 (H) и til1 (I). [См. Онлайн-статью для цветной версии этого рисунка.]

mos1 Преобразует колоски в ветви

Мутант mos1 был фертильным и выделился как рецессивный мутант. Во время вегетативного роста mos1 существенно не отличался от дикого типа и отличался от дикого типа только по соцветию (рис.4, А и Б). Однако во время репродуктивного роста соцветие дает примерно в два раза больше боковых колосков по сравнению с диким типом (рис. 4С; таблица II). Боковые колоски mos1 не были покрыты чешуей и поэтому считались ветвями. Каждая ветвь имела в среднем от 2,2 до 3,9 колосков, включая конечный колоск и первичные боковые колоски (Таблица II). Ветви давали несколько порядков колосков, так что одна ветвь давала первичные боковые колоски, которые, в свою очередь, давали вторичные боковые колоски (рис.4, Г и Д). Ветвистый верхний колосок также давал в среднем три вторичных колоска, и у них было в среднем 7,6 цветков, что меньше, чем количество цветков в колоске дикого типа (Таблицы I и II). Пороков органов у цветков не было. Колоски у основания ветвей, как правило, были небольшими с рудиментарными цветочками с уменьшенным количеством органов (рис. 4С; таблица II). Таким образом, мос1 приводит к разветвлению колоса Brachypodium.

Рисунок 4. Мутант

mos1 .A и B, Цветущее растение дикого типа (A) и mos1 (B). C, мос1 шип. Цифрами обозначены верхний колоск (1) и ветви (2–6). Д, мос1 филиал. Стрелками обозначены первичные боковые колоски. E, mos1 первичный боковой колоск. Стрелками обозначены вторичные боковые колоски. rs, рудиментарный колоск. [См. Онлайн-статью для цветной версии этого рисунка.]

Таблица II. Число ветвей, первичных колосков и цветков в соцветии mos1

mos1 развитие соцветий было дополнительно охарактеризовано с помощью SEM.На голой стадии развития боковые ветви казались похожими на колоски дикого типа, и каждая ветвь инициировала подмышечные меристемы, подчиненные развивающемуся органу (рис. 5, A и B). Когда ветви переходили в стадию зарождения ости, пазушные меристемы ветвей образовывали боковые колоски (первичные боковые колоски; рис. 5C). На каждой ветке образовалось от двух до четырех первичных боковых колосков (табл. II). Конечный колоск ветви можно было различить, так как он был покрыт чешуей и был более развит в развитии, чем боковые колоски.

Рисунок 5. Развитие соцветия

mos1 . A и B, обнаженная сцена. C, Ветвь на стадии инициации ости. D, соцветие, заключенное в конечную стадию колоска, с концевым колоском (1) и пятью ветвями. а, Awn; am, подмышечная меристема; б, ветвь; gl, чешуйка; l, лемма; плс, первичный боковой колоск; ц, концевой колоск. Штанги = 100 мкм.

Как и в соцветии дикого типа, развитие концевого колоска соцветия mos1 было более развитым, чем у боковых ветвей (рис.5D). Кроме того, были выражены различия в созревании ветвей вдоль соцветия. На стадии развития соцветий с закрытым концевым колоском четыре-шесть базальных ветвей находились на стадии зарождения ости, а две-три верхушечные ветви — на стадии голого развития. MOS1 , следовательно, по-видимому, участвует в производстве латеральных колосков, способствуя переходу меристемы соцветия в терминальный колоск и способствуя переходу пазушных меристем, продуцируемых соцветием, в судьбу колосков.

mos1 несет хромосомную перестройку перед геном фактора транскрипции ERF, относящимся к bd1

Ортологические гены ERF bd1 кукурузы и FZP риса необходимы для поддержания идентичности меристемы колосков (Chuck et al. , 2002; Komatsu et al., 2003a; Zhu et al., 2003). Мутации в обоих генах приводят к превращению детерминированных меристем колосков в меристемы неопределенных ветвей, напоминающих mos1 .Учитывая это сходство, мы проверили, может ли mos1 быть нарушен в гене, родственном Brachypodium bd1 . BD1 и FZP являются факторами транскрипции ERF, и существует 142 фактора транскрипции AP2 / ERF, кодируемых в геноме Brachypodium (Vogel et al., 2010). Используя аминокислотные последовательности BD1 и FZP для поиска аннотированных последовательностей белка Brachypodium, мы обнаружили только один близкородственный белок, кодируемый Bradi1g18580, который имеет общую аминокислотную идентичность в домене ERF и выходит за пределы этого домена (рис.6А; Vogel et al., 2010). Мы также идентифицировали Sb02g042400 из сорго ( Sorghum bicolor ) и предсказанный белок в последовательности генома ячменя как наиболее близкий к BD1 и FZP (Paterson et al., 2009; Mayer et al., 2012). Белок Bradi1g18580 имел 59%, 54%, 57% и 58% идентичности с BD1, FZP, Sb02g042400 и белком ячменя соответственно (фиг. 6A). Филогенетический анализ максимального правдоподобия этих белков, связанных с BD1, соответствовал взаимоотношениям между этими видами и показал, что белки Brachypodium и ячменя наиболее тесно связаны между собой (дополнительный рис.S4A; Келлог, 2001; Vogel et al., 2006). Чтобы проверить, был ли этот кандидат разрушен в mos1 , Bradi1g18580 амплифицировали с помощью ПЦР от дикого типа и mos1 . Секвенирование продуктов ПЦР не выявило мутаций в кодирующей области Bradi1g18580. Однако ПЦР-амплификация 5′-области Bradi1g18580 выявила разницу в размере продукта между продуктом дикого типа и mos1 . Секвенирование этих продуктов амплификации выявило делецию 10 п.н., простирающуюся от -170 до -180 п.н. выше стартового кодона ATG Bradi1g18580, а также уникальную вставку последовательности 991 п.н. на -170 п.н. выше стартового кодона ATG в mos1. по сравнению с диким типом (рис.6, Б и В). Интересно, что вставка была идентична последовательности на хромосоме 3, что позволяет предположить, что мутация возникла в результате хромосомной перестройки, когда сегмент хромосомы 3 вставлен в хромосому 1. Анализ последовательности показал, что вставка хромосомы 3 не имела признаков мобильного элемента и не имела иметь любые открытые рамки считывания, указывающие на последовательность, кодирующую белок. Чтобы определить, может ли эта вставка быть ответственной за фенотип mos1 , мы проверили косегрегацию между фенотипом mos1 и вставкой.В линиях, разделяющих mos1 , все 108 исследованных мутантов были гомозиготными по инсерционному аллелю, и все 36 исследованных фенотипических растений дикого типа либо не несли инсерционный аллель, либо были гетерозиготными по инсерционному аллелю и инсерционному аллелю. Основываясь на опубликованных частотах рекомбинации у Brachypodium, вставки выше Bradi1g18580 и mos1 , по оценкам, связаны менее чем на 100 kb (Huo et al., 2011).

Рисунок 6.

MOS1 соответствует мутации в ортологе Brachypodium bd1 и FZP .A. Выравнивание аминокислотных последовательностей предсказанных белков из Brachypodium MOS1 (белок, кодируемый Bradi1g18580), кукурузы BD1, FZP риса и ортологов BD1 сорго и ячменя. Цветовое затенение указывает процентную идентичность. Домен ERF подчеркнут. B, продукты амплификации ПЦР дикого типа и mos1 , амплифицированные с праймерами, показанными на C. Праймеры F5 и R5 обнаруживают полиморфизм вставки в mos1 . C, схематическое изображение Bradi1g18580 в mos1 с единственной открытой рамкой считывания (зеленый прямоугольник) и вставкой хромосомы 3 (красная линия).Цифры — это нуклеотиды, при этом цифра 1 — начало открытой рамки считывания. Стрелки указывают расположение праймеров. Нуклеотидная последовательность показывает область, несущую перестройку. Нуклеотиды красного цвета — это концы вставки хромосомы 3. Нуклеотиды, выделенные серым цветом, удалены в mos1 . Желтые прямоугольники выделяют нуклеотиды, которые сохраняются в Brachypodium, ячмене, кукурузе, рисе и сорго. D, количественная ОТ-ПЦР, показывающая уровни транскриптов MOS1 по сравнению с ACTIN2 в диком типе и мутант mos1 .Полоски = среднее значение.

Вставка в Bradi1g18580 нарушает высококонсервативную последовательность в Brachypodium, ячмене, рисе, кукурузе и сорго, включая сайт начала транскрипции ТАТА-бокса (рис. 6C; дополнительный рис. S4B). Чтобы определить, изменяет ли вставка уровни транскрипта Bradi1g18580, мы провели количественную обратную транскрипцию (RT) -PCR и обнаружили, что уровни транскрипта Bradi1g18580 были снижены в mos1 по сравнению с диким типом (фиг. 6D). Умеренное снижение уровней транскрипта MOS1 у мутанта указывает на то, что mos1 является слабым аллелем, который согласуется с мягким фенотипом mos1 по сравнению с аллелями bd1 и fpz .Взятые вместе, генетические, фенотипические и транскрипционные данные предполагают, что MOS1 соответствует Bradi1g18580.

ОБСУЖДЕНИЕ

Мутанты быстрых нейтронов в Brachypodium

Brachypodium представляет собой полезную модельную систему для исследования генетической регуляции развития колоса, поскольку это быстрорастущий и легко культивируемый вид с относительно небольшим геномом, который недавно был секвенирован (Draper et al. al., 2001; Vogel et al., 2010; Brkljacic et al., 2011). Мы создали условия для мутагенеза быстрых нейтронов и EMS.Скрининг популяций мутантов быстрых нейтронов выявил ряд фенотипических мутантов. Некоторые из мутантов онтогенеза имели фенотипы, сходные с мутантами, о которых сообщалось у других видов растений. Например, мутант с растущим вниз побегом был подобен агравитрофным мутантам lazy в кукурузе и рисе и serpentina в ячмене (Van Overbeek, 1936; Jones and Adair, 1938; Sheridan, 1988; Türkan and Suge, 1991). ).

Выявлен ряд мутантов с дефектами развития соцветий.У мутанта awl1 отсутствовали ости и было дефектное развитие пестика. Оости присутствуют в других видах трав, таких как рис, ячмень и пшеница, и, вероятно, выполняют функцию защиты от кормления животных и способствуют распространению семян, хотя ости также могут играть физиологическую роль в развитии семян (Grundbacher, 1963). Хотя еще предстоит определить, контролирует ли один-единственный ген развитие ости и пестика, мутант awl1 обеспечит понимание обоих процессов в развитии соцветий.

Мутанты nif1 и til1 имели сходство с другими описанными мутантами. Мутант nif1 , у которого отсутствовали колоски, напоминал мутанты, переносящие ауксин, pinformed1 , pinoid и monopterous у Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) и bif2 у кукурузы (Okada et al., 1991; Bennett et al., 1991; Bennett et al. al., 1995; Przemeck et al., 1996; McSteen et al., 2007). PINFORMED1 кодирует переносчик оттока ауксина, который экспрессируется на высоких уровнях в локализованных областях на периферии меристемы и необходим для образования локальных максимумов ауксина, связанных с инициацией органа (Reinhardt et al., 2003). Аналогичным образом, мутанты в bif2 , который кодирует протеинкиназу Ser / Thr, ортологичную PINOID , имеют меньше ветвей соцветий, колосков и органов цветка и не могут установить локализованные максимумы ауксина в периферических областях меристемы (McSteen et al. др., 2007; Скирпан и др., 2009). Потенциально nif1 также является дефектным в транспорте ауксина. Фенотип til1 был подобен фенотипу moc1 у риса и мутантам в ортологах ba1 кукурузы и LAX1 риса. MOC1 кодирует ген фактора транскрипции семейства GRAS, тогда как ba1 и LAX1 кодируют ортологичные основные факторы транскрипции спираль-петля-спираль (Komatsu et al., 2003b; Li et al., 2003; Gallavotti et al., 2004 ). Ортологи Brachypodium этих генов, следовательно, представляют кандидатов на TIL1 .

Сравнение развития соцветий у брахиподиума с мелкозерновыми злаками Пшеница и ячмень

Брахиподиум является членом подсемейства Pooideae семейства Poaceae и тесно связан с двумя основными видами мелкозерновых злаков — пшеницей и ячменем (Hsiao et al. al., 1994; Vogel et al., 2006). Основываясь на нашем анализе Brachypodium дикого типа, информативно сравнить это с развитием соцветий у пшеницы и ячменя, поскольку генетическая регуляция развития соцветий, вероятно, будет в высокой степени консервативной у этих родственных видов. Соцветие всех трех видов — колосовидное. Колосья ячменя характеризуется неопределенным соцветием и детерминированными колосками (Bonnett, 1935; Kirby, Appleyard, 1981; Babb, Muehlbauer, 2003). Пазушные меристемы вдоль главной оси соцветия дают три колоска, и каждый из этих колосков дает единственный цветочек.У пшеницы соцветие детерминантное, и меристема соцветия продолжает продуцировать пазушные меристемы до тех пор, пока не сформируется терминальный колоск (Bonnett, 1936; Kirby and Appleyard, 1981). Каждая пазушная меристема на соцветии пшеницы развивается в один боковой колоск. И верхние, и боковые колоски дают несколько цветков. Колосья соцветия Brachypodium сходно с колосом пшеницы, при этом соцветие является детерминантным, а колоски неопределенными.Более того, соцветия в колоске созревают акропетально как у Brachypodium, так и у пшеницы. Однако у пшеницы наблюдается градация созревания колосков по оси соцветия. Колоски развиваются акропетально и базипетально из средней части соцветия, причем последний созревает последним (Bonnett, 1935, 1936; Kirby, Appleyard, 1981). Напротив, развитие терминального колоска у Brachypodium более развито по сравнению с латеральными колосками. Сложнее сделать выводы об относительном графике созревания нескольких боковых колосков у Brachypodium дикого типа.Однако в mos1 развитие базальных боковых ветвей было более развитым, чем развитие апикальных боковых ветвей, указывая тем самым, что развитие вдоль главной оси соцветия у Brachypodium является акропетальным. Таким образом, есть поразительное сходство между развитием соцветий у Brachypodium и пшеницы, но тонкие различия могут отражать различную регуляцию созревания меристемы, а не зарождение.

mos1 Преобразует неразветвленный шип в разветвленный шип

Мы создали описание развития шипа дикого типа Brachypodium и использовали его для определения роли MOS1 в архитектуре шипа.Мутация в MOS1 приводит к увеличению числа пазушных меристем на главной оси соцветия, которые развиваются в виде ветвей, а не колосков. Повышенное количество подмышечных меристем может быть результатом задержки в формировании терминального колоска. MOS1 , следовательно, может либо способствовать продукции терминального колоска и определять судьбу меристемы, либо репрессировать судьбу неопределенной меристемы соцветия. Боковые пазушные меристемы в соцветии mos1 не покрыты чешуей и поэтому могут считаться скорее ветвями, чем колосками.Каждая ветка напоминает главное соцветие дикого типа, образуя несколько боковых колосков и верхний колоск. Таким образом, идентичность меристемы колосков преобразуется в идентичность меристемы ветвления и аналогична фенотипам мутантов bd1 и fzp кукурузы и риса.

Мутантные аллели bd1 и fzp различаются по степени тяжести фенотипа. У тяжелых мутантов bd1 , мутации которых предсказывают усечение белка BD1, колоски кисточек являются неопределенными и образуют серию боковых колосков, а колоски ушей превращаются в неопределенные ветви (Chuck et al., 2002). Слабый аллель со сниженным уровнем транскрипта из-за вставки транспозона в 5′-лидерную последовательность bd1 приводит к образованию меньшего количества ветвей в ухе по сравнению с тяжелыми аллелями и является частично фертильным (Chuck et al., 2002). У тяжелых мутантов fzp все колоски на первичных ветвях метелки превращаются во вторичные ветви, тогда как у растений со слабым аллелем fzp колоски и иногда плодовитые соцветия образуются на концах первичных ветвей (Komatsu et al. ., 2001, 2003а; Чжу и др., 2003; Йи и др., 2005). Слабый аллель fzp имеет аминокислотную замену в ERF-домене FZP. Тяжелые аллели fzp имеют мутации, которые изменяют аминокислоты в домене ERF или, как предполагается, продуцируют C-концевые усеченные белки. Кроме того, два тяжелых мутанта fzp несут вставки транспозона более чем на 1 т.п.н. выше кодирующей области, что, вероятно, нарушает экспрессию FZP через отдаленную цис-регуляторную область (Komatsu et al., 2003a; Чжу и др., 2003). Таким образом, помимо функции белка, регуляция транскрипции bd1 и FZP важна для образования колосков и для определения степени ветвления соцветий у кукурузы и риса. Как и в случае слабых аллелей bd1 и fzp , мутанты mos1 являются фертильными. mos1 имеет хромосомную перестройку в промоторной области гена, и уровни транскриптов снижены по сравнению с диким типом. Поэтому мы предполагаем, что mos1 может быть слабым аллелем, фенотип которого является результатом более низких уровней накопления транскриптов или задержки начала экспрессии.

Неразветвленный колос Brachypodium отличается от разветвленного соцветия кукурузы и риса, и один ген, который может способствовать этому различию, — это bd1 / FZP / MOS1 . Мы показываем, что MOS1 , вероятно, соответствует мутации, которая приводит к снижению уровней транскрипта в ортологе Brachypodium bd1 и FZP . Дальнейшее снижение экспрессии MOS1 за счет выделения дополнительных мутантных аллелей или за счет использования сайленсинга генов подтвердит этот вывод, а также покажет, в какой степени MOS1 требуется для детерминации меристемы.В частности, фенотип нулевого мутанта mos1 будет устанавливать, зависит ли спецификация терминального колоска от экспрессии MOS1 . Изменения в уровне или характере экспрессии этого гена могут определять, является ли соцветие травы разветвленным или нет. Хотя bd1 , FZP и MOS , по-видимому, играют консервативную роль в судьбе меристемы колосков, мы показываем, что MOS1 в Brachypodium также играет роль в детерминации меристемы соцветия.Одна из возможностей состоит в том, что MOS1 регулирует время инициации терминального колоса. У пшеницы дифференциация верхних колосков определяет количество образовавшихся колосков (Bonnett, 1935, 1936). MOS1 , таким образом, является хорошим геном-мишенью для генетических манипуляций с целью увеличения количества зерен и урожайности пшеницы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал и условия роста

Brachypodium ( Brachypodium distachyon ) Bd21, используемый в качестве дикого типа, был десятым поколением односемянного происхождения и выращивался либо в камере для выращивания, либо в теплице на 22 ° C при 18-часовом освещении.Семена высевали на влажную фильтровальную бумагу, помещали при 4 ° C в темноте на 7 дней и проращивали либо при комнатной температуре, либо в камере для выращивания в течение 4 дней перед пересадкой в ​​почву, состоящую из 50% компоста и 50% торфа и песка. смесь с добавлением удобрений с медленным высвобождением. Подробные фенотипические исследования дикого типа и мутантов были проведены на растениях, выращенных в камере для выращивания.

Мутагенез на быстрых нейтронах семян Brachypodium был проведен в Исследовательском институте атомной энергии в Будапеште, Венгрия.Для определения дозы, необходимой для мутагенеза быстрых нейтронов, семена Brachypodium первоначально подвергались воздействию 20, 30, 40, 50 и 60 Гр. Семена M1 проверяли на жизнеспособность и плодовитость проростков. Семена, подвергнутые дозе 50 и 60 Гр, все прорастали, но не давали никаких постэмбриональных органов. Воздействие 40 Гр привело к прорастанию 25% семян M1 и росту проростков, а 22% растений были фертильными. Воздействие 30 Гр обеспечило прорастание 65% семян M1, и 60% растений были фертильными. На основе этого первоначального теста был проведен второй мутагенез, и семена подверглись воздействию 20, 25, 30 и 35 Гр.Семена, подвергнутые воздействию 35 Гр, имели низкую жизнеспособность проростков, и все созревшие растения были стерильными. Воздействие 20, 25 и 30 Гр обеспечило от 30% до 50% жизнеспособности проростков. Только при 20 Гр наиболее жизнеспособные сеянцы оплодотворяли. Были собраны семена от отдельных плодородных растений M1. Мы проверили потомство M2 от 203 линий M1, подвергшихся воздействию 30 Гр из первого мутагенеза, и 669 линий M1, подвергшихся воздействию 20 и 30 Гр из второго мутагенеза, на предмет видимых фенотипов побегов. Для скрининга мутантных фенотипов примерно 40 семян M2 от каждого растения M1 проращивали и высаживали в почву для визуального исследования.

EMS-мутагенез проводили путем сначала пропитывания очищенных от шелухи семян, а затем обработки EMS. Очищенные семена пропитывали, помещая на влажную фильтровальную бумагу на 48 часов при 4 ° C. Семена собирали и обрабатывали 0,2%, 0,4% или 0,6% (об. / Об.) EMS в 40 мл воды в течение 8 часов при комнатной температуре. В качестве контроля некоторые семена обрабатывали без EMS. После химической обработки семена промывали водой шесть раз по 30 мин. Обработанные семена помещали на влажную фильтровальную бумагу и помещали при 4 ° C на 48 часов, а затем переносили в комнатную температуру и давали прорасти перед пересадкой в ​​почву.В контроле 68% семян проросли и дали плодородные растения по сравнению с 99% прорастанием необработанных семян, что указывает на то, что погружение семян в течение нескольких часов снижает их жизнеспособность. Скрининг на мутанты проводили по мутагенезу на быстрых нейтронах.

Molecular Biology

Выделение геномной ДНК проводили с использованием метода бромида цетилтриметиламмония, как описано ранее (Long and Coupland, 1998). Секвенирование генов-кандидатов проводили на мутантных растениях и на родительских растениях дикого типа, используемых для мутагенеза. MOS1 Праймеры для амплификации геномной ДНК, секвенирования и генотипирования были следующими: прямой, 5′-CCCCTTGTAGCTTAGCTCCTC-3 ‘; обратный, 5’-GGCGTAGACGAAGTTGGTG-3 ‘; вперед, 5’-GACCCGACGACCAAGGAG-3 ‘; обратный, 5’-CGTCCGACACCGAGTACC-3 ‘; вперед, 5’-AATCATCACACTGCCTGCAT-3 ‘; вперед, 5′-CGAGGACTTCTTCTGCTTCTC; и наоборот, 5’-TGCATGCATATGGAAACGTAG-3 ‘. MOS1 (Bradi1g18580) праймерами, использованными для количественной ОТ-ПЦР, были 5′-CGTACGGGTACGGCATGAT-3 ‘и 5′-CAGTGGGAGAGGAAGCTGAA-3’. BdACTIN2 (Bradi1g10630) праймерами, использованными для количественной ОТ-ПЦР, были 5′-GTCGTTGCTCCTCCTGAAAG-3 ‘и 5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGT-3’.Косегрегация полиморфизма вставки в растениях Bradi1g18580 и фенотипических мутантных mos1 растений была определена путем анализа потомства дикого типа и мутантного потомства из семи независимых линий M2. Количественный анализ ОТ-ПЦР проводили с использованием девяти меристем соцветий, срезанных с 18-дневных растений. Тотальную РНК экстрагировали из ткани соцветия с использованием реагента TRI (Sigma-Aldrich) и ДНКазу, обработанную и очищенную на колонке (Qiagen) перед синтезом комплементарной ДНК с использованием обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen).Количественную ОТ-ПЦР проводили с использованием набора для количественной ОТ-ПЦР SYBR Green JumpStart (Sigma-Aldrich). Количественные реакции RT-PCR проводили в трех повторностях. BdACTIN2 (Bradi1g10630) использовали для нормализации экспрессии гена.

Гистология и гибридизация in situ

Для анализа стадий развития соцветий верхушки растений фиксировали в 4% (мас. / Об.) Параформальдегиде, дегидратировали в этаноле и заливали воском. Вложенный материал был разрезан, очищен и окрашен 0.1% (мас. / Об.) Толуидиновый синий. Гибридизацию РНК in situ проводили, как описано ранее (Long et al., 1996). Для BdKN1 ген-специфический фрагмент длиной 747 п.н. амплифицировали из комплементарной ДНК с праймерами 5′-CATCTCCCACCCCATTTACCCT-3 ‘и 5′-TAGAGCCCACCATCGTTGATGA-3’ и клонировали в вектор pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) . Антисмысловой зонд получали из этого клона транскрипцией in vitro фрагмента BdKN1 в присутствии дигоксигенин-UTP и последующим гидролизом на более мелкие фрагменты длиной приблизительно 150 п.н. перед использованием в гибридизации.

SEM

Чтобы подготовить ткань для SEM, с растений вырезали верхушки и удаляли окружающие ткани листьев, чтобы обнажить меристемы. Вершины устанавливали в горизонтальном положении на алюминиевые стержни и погружали в жидкий азот. После замораживания образцы сразу загружали в криокамеру криопереносной системы ALTO 2500 (Gatan), присоединенной к сканирующему электронному микроскопу Zeiss Supra 55 VP FEG. Образцы напыляли платиной и отображали при 3 кВ.

Выравнивание последовательностей и филогенетический анализ

Аминокислотные последовательности KNOX и BD1 были проанализированы с использованием MEGA версии 5. Последовательности были выровнены с помощью ClustalW, и филогенетическое дерево было построено с использованием алгоритма максимального правдоподобия с моделью эволюции белка JTT + G и 1000 реплик начальной загрузки. Это было определено как наиболее подходящая модель с использованием Protest 3 (Darriba et al., 2011). Было показано, что гены KNOX класса I растений являются монофилетическими (Kerstetter et al., 1994; Malcomber et al., 2006), поэтому дерево было укоренено с помощью белка KNOX Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ) класса II Arabidopsis , связанного с узлом -like7 (KNAT7) в качестве внешней группы. Дерево BD1 было укоренено родственным белком PUCHI (AT5G18560) из Arabidopsis и включало BD1 и близкородственный ген кукурузы ( Zea mays ) ZM2G458437 (Chuck et al., 2002), FZP, Sb02g042400, предсказанный белок в ячмень ( Hordeum vulgare ) morex-contig-1558332; и Bradi1g18580 (MOS1).Номера доступа GenBank для Arabidopsis, кукурузы и риса ( Oryza sativa ) последовательности белка KNOX были следующими: BREVIPEDICELLUS, AEE82597.1; GNARLEY1, AAP76320.1; KN1, AAP21616.1; KNAT2, AEE35073.1; KNAT6, AEE30380.1; KNAT7 AF308451; KNOX3, ACG37067.1; KNOX8, ACF81686.1; KNOX10, ACF85627.1; LIGULELESS4a, AAP31409.1; LG3, AAD13611.1; ОШ2, БАА03959.1; ОШ4, БАА79223.1; ОШ6, BAA79224.1; ОШ20, ААР87192.1; ОШ25, БАА31688.1; ОШ53, БАА79225.1; OSH71, BAA79226.1; ШЕРОХОВАЯ ОБОЛОЧКАh2, AAA86287.1; и СТРЕЛЯТЬ БЕЗУПРЕЧНЫМ, AEE33958.1. Номера доступа в GenBank для последовательностей белков BD1 / FZP кукурузы и риса были следующими: BD1, ACG41675.1; ZM2G458437, DAA41703.1; и FZP, BAC79264.1. Последовательности Brachypodium, Bradi1g07247, Bradi1g10047 ( BdKN1 ), Bradi1g12677, Bradi1g12690, Bradi1g57607, Bradi2g11540, Bradi2g38390 и Bradi1g18580 (MOS1) были идентифицированы из сборки последовательности генома и др. (V2010) Последовательности BD1 сорго ( Sorghum bicolor ) и ячменя были идентифицированы из геномных сборок (Paterson et al., 2009; Mayer et al., 2012).

Дополнительные данные

Следующие материалы доступны в онлайн-версии этой статьи.

Благодарности

Мы благодарим Эрика Фоллбрехта и Зака ​​Липпмана за комментарии к рукописи; Саймону Хо за помощь в филогенетическом анализе; Дэвид Гарвин за предоставленные семена Brachypodium Bd21; Jozsef Palfalvi для обработки семян быстрыми нейтронами; Саре Коллиер за техническую помощь; и Эндрю Дэвис за фотографию растений.

Сноски

  • Автор несет ответственность за распространение материалов, составляющих выводы, представленные в этой статье, в соответствии с политикой, описанной в Инструкциях для авторов (www.plantphysiol.org): Мэри Э. Бирн (mary.byrne {at} sydney.edu.au).

  • www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.112.212340

  • ↵1 Эта работа была поддержана Сиднейским университетом, Исследовательским советом биотехнологии и биологических наук и Королевским обществом.

  • ↵ [C] Некоторые рисунки в этой статье отображаются в Интернете в цвете, а в печатном издании — в черно-белом.

  • ↵ [OA] Статьи в открытом доступе можно просматривать в Интернете без подписки.

  • ↵ [W] Онлайн-версия этой статьи содержит данные только для Интернета.

Глоссарий

SEM
сканирующая электронная микроскопия
EMS
этилметансульфонат
Gy
Серый
RT
обратная транскрипция
das
d после посева фактор отклика
ERF

Этилен

  • Поступила 5 декабря 2012 г.
  • Принята 24 января 2013 г.
  • Опубликовано 25 января 2013 г.

Жасмоновая кислота регулирует развитие колосков в рисе

  • 1

    Group, G. P. W. Филогения и подсемейная классификация злаков (Poaceae). Ann. Миссури. Бот. Гард. 88 , 373–457 (2001).

    Артикул

    Google ученый

  • 2

    Шмидт Р. Дж. И Амброуз Б. А. Цветение травянистых цветков. Curr. Opin. Plant Biol. 1 , 60–67 (1998).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 3

    Танака В., Паутлер М., Джексон Д. и Хирано Х. Ю. Меристемы травы II: архитектура соцветий, развитие цветов и судьба меристем. Завод. Cell Physiol. 54 , 313–324 (2013).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 4

    Юань, З. и др. RETARDED PALEA1 контролирует развитие палеа и цветочную зигоморфию риса. Plant Physiol. 149 , 235–244 (2009).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 5

    Ямагути Н. и др. Молекулярный каркас для ауксин-опосредованной инициации зачатков цветков. Dev. Ячейка 24 , 271–282 (2013).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 6

    Лю, К., Тонг, З. и Ю, Х. Начало цветения: спецификация цветочных меристем. Развитие 136 , 3379–3391 (2009).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 7

    Вагнер, Д. Морфогенез цветка: время является ключевым моментом. Dev. Ячейка 16 , 621–622 (2009).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 8

    Ferrandiz, C., Gu, Q., Martienssen, R. & Yanofsky, M. F. Избыточное регулирование идентичности меристем и архитектуры растений с помощью FRUITFULL , APETALA1 и CAULIFLOWER . Развитие 127 , 725–734 (2000).

    CAS
    PubMed

    Google ученый

  • 9

    Каузье, Б., Шварц-Зоммер, З. и Дэвис, Б. Идентификация цветочных органов: 20 лет азбуки. Семин. Cell Dev. Биол. 21 , 73–79 (2010).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 10

    Икеда-Кавакацу, К., Маэкава, М., Идзава, Т., Ито, Дж.& Nagato, Y. ABERRANT PANICLE ORGANIZATION 2 / RFL , рисовый ортолог Arabidopsis LEAFY , подавляет переход от меристемы соцветия к меристеме цветков посредством взаимодействия с APO1 . Plant J. 69 , 168–180 (2012).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 11

    Kobayashi, K. et al. Идентичность меристемы соцветия у риса определяется перекрывающимися функциями трех AP1 / FUL -подобных генов MADS-бокса и PAP2 , гена SEPALLATA MADS-бокса. Растительная клетка 24 , 1848–1859 (2012).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 12

    Рао Н. Н., Прасад К., Кумар П. Р. и Виджайрагхаван Ю. Особая регулирующая роль RFL , гомолога риса LFY , в определении времени цветения и архитектуры растений. Proc. Natl Acad. Sci. США 105 , 3646–3651 (2008).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 13

    Чон, Дж.S. et al. со стерильной оболочкой1 — гомеотическая мутация в гене MADS-бокса риса, влияющая на развитие цветков риса. Растительная клетка 12 , 871–884 (2000).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central

    Google ученый

  • 14

    Malcomber, S. T. & Kellogg, E. A. Неоднородные паттерны экспрессии и отдельные роли гена SEPALLATA LEAFY HULL STERILE1 в травах. Растительная клетка 16 , 1692–1706 (2004).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 15

    Chen, Z. X. et al. Морфогенез и молекулярные основы риса без семян, новая гомеотическая мутация OsMADS1 , регулирующая уровень транскрипта AP3 гомолога в рисе. Planta 223 , 882–890 (2006).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 16

    Чак, Г., Мили, Р.B. & Hake, S. Контроль судьбы меристемы колосков кукурузы с помощью APETALA2 -подобного гена неопределенного колоска 1 . Genes Dev. 12 , 1145–1154 (1998).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 17

    Chuck, G., Meeley, R. & Hake, S. Инициирование цветочной меристемы и судьба клеток меристемы регулируются генами AP2 кукурузы ids1 и sid1 . Развитие 135 , 3013–3019 (2008).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 18

    Lee, D. Y., Lee, J., Moon, S., Park, S. Y. & An, G. Гетерохронный ген риса SUPERNUMERARY BRACT регулирует переход от меристемы колосков к меристеме цветков. Завод J 49 , 64–78 (2007).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 19

    Ли, Д.Y. & An, G. Два гена семейства AP2 , Supernumerary Bract ( SNB ) и Osindeterminate spikelet 1 ( OsIDS1 ), синергетически контролируют архитектуру соцветия и установление цветочной меристемы у риса. Plant J. 69 , 445–461 (2012).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 20

    Акоста, И. Ф. и Фармер, Э. Э. Жасмонатес. Arabidopsis Book 8 , e0129 (2010).

    Артикул

    Google ученый

  • 21

    Browse, J. Возможности мутантов для исследования биосинтеза и передачи сигналов жасмоната. Фитохимия 70 , 1539–1546 (2009).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 22

    Browse, J. & Howe, G.A. Новое оружие и быстрое реагирование на нападение насекомых. Plant Physiol. 146 , 832–838 (2008).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 23

    Кесслер А., Халичке Р. и Болдуин И. Т. Выключение жасмонатного каскада: индуцированная защита растений и популяции насекомых. Наука 305 , 665–668 (2004).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 24

    Wasternack, C. & Hause, B. Jasmonates: биосинтез, восприятие, передача сигнала и действие в ответ на стресс, рост и развитие растений.Обновление обзора 2007 года в Annals of Botany. Ann. Бот. 111 , 1021–1058 (2013).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 25

    Hyun, Y. et al. Кооперация и функциональная диверсификация двух тесно связанных генов галактолипазы для биосинтеза жасмоната. Dev. Ячейка 14 , 183–192 (2008).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 26

    Исигуро, С., Kawai-Oda, A., Ueda, J., Nishida, I. & Okada, K. Ген ДЕФЕКТ ДРУГОГО ОТКЛОНЕНИЯ кодирует новую фосфолипазу A1, катализирующую начальную стадию биосинтеза жасмоновой кислоты, которая синхронизирует созревание пыльцы, пыльник раскрытие и раскрытие цветка Arabidopsis . Растительная клетка 13 , 2191–2209 (2001).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 27

    Ellinger, D. et al. DONGLE и ДЕФЕКТНЫ ПРИ ДРУГИХ ДЕИСЦЕНЦИЯХ1 Липазы не важны для биосинтеза жасмоната, индуцированного раной и патогеном: избыточные липазы способствуют образованию жасмоната. Plant Physiol. 153 , 114–127 (2010).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 28

    Chini, A. et al. Семейство репрессоров JAZ — недостающее звено в передаче сигналов жасмоната. Природа 448 , 666–671 (2007).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 29

    Кацир, Л., Шилмиллер, А. Л., Стасвик, П. Э., Хе, С. Ю. и Хоу, Г. А. COI1 является критическим компонентом рецептора жасмоната и фактора вирулентности бактерий коронатина. Proc. Natl Acad. Sci. США 105 , 7100–7105 (2008).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 30

    Мелотто, М.и другие. Критическая роль двух положительно заряженных аминокислот в мотиве Jas белков Arabidopsis JAZ в опосредовании коронатин- и жасмоноилизолейцин-зависимых взаимодействий с F-бокс-белком COI1. Plant J. 55 , 979–988 (2008).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 31

    Sheard, L. B. et al. Восприятие жасмоната корецептором COI1-JAZ, потенцированным инозитолфосфатом. Природа 468 , 400–405 (2010).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 32

    Thines, B. et al. Белки-репрессоры JAZ являются мишенями комплекса SCF COI1 во время передачи сигналов жасмонатом. Природа 448 , 661–665 (2007).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 33

    Се, Д. Х., Фейс, Б. Ф., Джеймс, С., Ньето-Ростро, М. и Тернер, Дж. Г. COI1 : ген Arabidopsis , необходимый для регулируемой жасмонатом защиты и фертильности. Наука 280 , 1091–1094 (1998).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 34

    Xu, L. et al. Комплексы убиквитин-лигаза SCF COI1 необходимы для жасмонатного ответа в Arabidopsis . Растительная клетка 14 , 1919–1935 (2002).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 35

    Ян Дж.и другие. Белок Arabidopsis CORONATINE INSENSITIVE1 является рецептором жасмоната. Растительная клетка 21 , 2220–2236 (2009).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 36

    Li, H. et al. Предполагаемый ген липазы EXTRA GLUME1 регулирует судьбу пустой чешуи и развитие колосков у риса. Plant J. 57 , 593–605 (2009).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 37

    Ли, Х.Y. et al. Гомологи Oryza sativa COI восстанавливают передачу жасмонатного сигнала у мутантов Arabidopsis coi1-1 . PLoS One 8 , e52802 (2013).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 38

    Cui, R. et al. Функциональное сохранение и диверсификация цветочных гомеотических генов класса E в рисе ( Oryza sativa ). Plant J. 61 , 767–781 (2010).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 39

    Gao, X. et al. SEPALLATA -подобный ген OsMADS34 необходим для развития соцветий и колосков риса. Plant Physiol. 153 , 728–740 (2010).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 40

    Кобаяси, К., Маэкава, М., Мияо, А., Хирочика, Х. и Киодзука, Дж. PANICLE PHYTOMER2 ( PAP2 ), кодирующий белок подсемейства SEPALLATA MADS-box, положительно контролирует идентичность меристемы колосков риса. Physiol растительных клеток. 51 , 47–57 (2010).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 41

    Lorenzo, O., Chico, J. M., Sanchez-Serrano, J. J. & Solano, R. JASMONATE-INSENSITIVE1 кодирует фактор транскрипции MYC, необходимый для различения различных регулируемых жасмонатом защитных реакций в Arabidopsis . Растительная клетка 16 , 1938–1950 (2004).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 42

    Казань, К. и Маннерс, Дж. М. MYC2: Мастер в действии. Мол. Завод 6 , 686–703 (2013).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 43

    Fernandez-Calvo, P. et al. Факторы транскрипции MYC3 и MYC4 Arabidopsis bHLH являются мишенями для репрессоров JAZ и действуют аддитивно с MYC2 при активации жасмонатных ответов. Растительная клетка 23 , 701–715 (2011).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 44

    Feys, B., Benedetti, C.E., Penfold, C.N. & Turner, J.G. Мутанты Arabidopsis , отобранные по устойчивости к фитотоксину коронатину, стерильны по мужской линии, нечувствительны к метилжасмонату и устойчивы к бактериальным патогенам. Растительная клетка 6 , 751–759 (1994).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 45

    Li, L.и другие. Гомолог CORONATINE-INSENSITIVE1 томата необходим для материнского контроля созревания семян, защитных реакций, сигнализируемых жасмонатом, и развития железистых трихом. Растительная клетка 16 , 126–143 (2004).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 46

    Acosta, I. F. et al. Tasselseed1 — это липоксигеназа, влияющая на передачу сигналов жасмоновой кислоты при определении пола кукурузы. Наука 323 , 262–265 (2009).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 47

    Browse, J. Jasmonate: предотвращение соприкосновения кукурузной кисточки с его женской стороной. Sci. Сигнал. 2 , pe9 (2009).

    Артикул

    Google ученый

  • 48

    Yan, Y. et al. Нарушение OPR7 и OPR8 раскрывает универсальные функции жасмоновой кислоты в развитии и защите кукурузы. Растительная клетка 24 , 1420–1436 (2012).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 49

    Чжан Д. Б. и Юань З. Молекулярный контроль развития соцветий травы. Annu. Преподобный завод. Биол (DOI: 10.1146 / annurev-arplant-050213-040104).

  • 50

    Yoshida, A., Suzaki, T., Tanaka, W. и Hirano, H.Y. Гомеотический ген длинной стерильной леммы ( G1 ) определяет идентичность стерильной леммы в рисовом колоске. Proc. Natl Acad. Sci. США 106 , 20103–20108 (2009).

    CAS
    ОБЪЯВЛЕНИЯ
    Статья

    Google ученый

  • 51

    Tanaka, W. et al. Ген YABBY TONGARI-BOUSHI1 участвует в развитии латеральных органов и поддержании организации меристемы в рисовом колоске. Растительная клетка 24 , 80–95 (2012).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 52

    Чжан, Д.Б., Юань, З., Ан, Г., Дрени, Л., Ху, Дж. П. и Катер, М. Развитие метелки. Генетика и геномика риса, генетика и геномика растений: культуры и модели 5 , 279–295 (2013).

    Артикул

    Google ученый

  • 53

    Li, H. et al. AGL6 -подобный ген OsMADS6 регулирует идентичность цветочных органов и меристем у риса. Ячейка. Res. 20 , 299–313 (2010).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 54

    Омори, С.и другие. MOSAIC FLORAL ORGANS1, AGL6-подобный ген MADS-бокса, регулирует идентичность цветочных органов и судьбу меристемы у риса. Растительная клетка 21 , 3008–3025 (2009).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 55

    Li, H. et al. Рис MADS6 взаимодействует с генами цветочного гомеоза SUPERWOMAN1 , MADS3 , MADS58 , MADS13 и DROOPING LEAF в определении идентичности цветочных органов и судьбы меристемы. Растительная клетка 23 , 2536–2552 (2011).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 56

    Thompson, B.E. et al. bearded-ear кодирует фактор транскрипции MADS-бокса, критический для развития цветков кукурузы. Растительная клетка 21 , 2578–2590 (2009).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 57

    Икеда, К., Сунохара, Х.& Нагато, Ю. Ход развития соцветия и колоска в рисе. Порода. Sci. 54 , 147–156 (2004).

    Артикул

    Google ученый

  • 58

    Барт, Р., Черн, М., Парк, К. Дж., Бартли, Л. и Рональд, П. С. Новая система подавления генов с использованием миРНК в протопластах, полученных из листьев и стеблей риса. Заводские методы 2 , 13 (2006).

    Артикул

    Google ученый

  • 59

    Воиннет, О., Rivas, S., Mestre, P. & Baulcombe, D. Система усиленной временной экспрессии в растениях, основанная на подавлении молчания генов белком p19 вируса кустарниковой роста томатов. Plant J. 33 , 949–956 (2003).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 60

    Fu, J., Chu, J., Sun, X., Wang, J. & Yan, C. Простой, быстрый и одновременный анализ множества карбоксилсодержащих фитогормонов в раненых помидорах с помощью UPLC-MS / MS с использованием однократной очистки SPE и изотопного разбавления. Анал. Sci. 28 , 1081–1087 (2012).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 61

    Джефферсон, Р. А., Кавана, Т. А. и Беван, М. В. Слияние GUS: бета-глюкуронидаза как чувствительный и универсальный маркер слияния генов у высших растений. EMBO J. 6 , 3901–3907 (1987).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 62

    Ли, Л.Ю., Фанг, М. Дж., Куанг, Л. Ю. и Гельвин, С. Б. Векторы для комплементации многоцветной бимолекулярной флуоресценции для исследования белок-белковых взаимодействий в живых клетках растений. Заводские методы 4 , 24 (2008).

    Артикул

    Google ученый

  • 63

    Bai, M. Y. et al. Брассиностероид, гиббереллин и фитохром влияют на общий модуль транскрипции в Arabidopsis . Нац. Клетка. Биол. 14 , 810–817 (2012).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 64

    Hellens, R.P. et al. Векторы временной экспрессии для функциональной геномики, количественной оценки промоторной активности и молчания РНК в растениях. Заводские методы 1 , 13 (2005).

    Артикул

    Google ученый

  • MULTI-FLORET SPIKELET 2, фактор транскрипции MYB, определяет судьбу меристемы колосков и идентичность цветочных органов риса | Физиология растений

    Аннотация

    Понимание развития цветков и метелок имеет решающее значение для повышения урожайности и качества большинства травяных культур.В этом исследовании мы использовали клонирование на основе картирования для идентификации MULTI FLORET SPIKELET2 ( MFS2 ), который кодирует фактор транскрипции MYB и регулирует развитие цветков и колосков у риса ( Oryza sativa ). У мутанта mfs2 спецификация палеа была сильно нарушена и демонстрировала деградацию или трансформацию в похожий на лемму орган, а количество всех цветковых органов увеличивалось в различной степени. Из-за увеличения числа цветковых органов и развития дополнительных трансформированных палеа / краевой области палеа-подобных органов около колосков mfs2 имели тенденцию давать два цветочка.Эти дефекты означают, что мутация mfs2 вызывает аномальную спецификацию идентичности палеа и частичную потерю детерминации колосков. Мы подтверждаем, что MFS2 является репрессором транскрипции, который демонстрирует сильную репрессивную активность с помощью двух типичных амфифильных мотивов, связанных с фактором связывания этилен-чувствительного элемента, один из которых расположен на С-конце и способен взаимодействовать с тремя рисом TOPLESS и TOPLESS. -зависимые белки. Результаты показывают, что MFS2 действует как репрессор, который регулирует идентичность цветочных органов и детерминированность меристемы колосков у риса, образуя комплекс репрессии с белками, родственными TOPLESS и TOPLESS риса.

    Соцветие и цветок, которые являются характерными репродуктивными структурами покрытосеменных растений, оказывают большое влияние на урожайность сельскохозяйственных культур. Во время репродуктивной фазы покрытосеменных апикальная меристема побега сначала дифференцируется в меристему соцветия (IM), на которой формируются боковая и конечная меристема цветка (FM) и обычно дают начало четырем оборотам цветочных органов (чашелистиков, лепестков, тычинок и carpels; McSteen et al., 2000).

    Судьба IM лежит в основе производства FM.Что касается поведения апикальных меристем соцветия, IM классифицируется как неопределенный или детерминированный в зависимости от того, остается ли меристема постоянно активной или трансформируется в терминальную FM. Неопределенный IM, такой как Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ), непрерывно продуцирует боковые FM, но не трансформируется в конечный FM; детерминированный IM, такой как табак ( Nicotiana tabacum ), окончательно трансформируется в конечный FM после получения фиксированного количества боковых FM (Bradley et al., 1997; Рэтклифф и др., 1999; Сассекс и Керк, 2001; Чак и др., 2008). У Arabidopsis TERMINAL FLOWER ( TFL ) и LEAFY экспрессируются в IM и антагонистически регулируют идентичность IM (Prusinkiewicz et al., 2007). TFL ингибирует приобретение судьбы FM в верхнем домене IM, а мутанты tfl продуцируют детерминированное соцветие с концевым цветком. Напротив, TFL способствует образованию FM в латеральном домене IM, мутация которого приводит к образованию вторичных IM вместо латеральных FM (Alvarez et al., 1992; Blázquez et al., 1997; Mimida et al., 2001).

    Соцветие злаков обычно называют метелкой, оно состоит из основного рахиса, ветки, колоска и цветочка, которые образовались упорядоченным образом после индукции цветков. У риса ( Oryza sativa ) ветвящиеся меристемы (BM) регулируются с помощью механизма, аналогичного IMs Arabidopsis, посредством чего рис TFL1 -ортологи RICE CENTRORADIALIS1 ( RCN1 ) или RCN2 продлевают судьбу IM. .Сверхэкспрессия RCN1 или RCN2 задерживает переход BM в меристемы колосков (SM) и в конечном итоге приводит к продукции большего количества ветвей и колосков, чем у дикого типа (Nakagawa et al., 2002; Rao et al. др., 2008). Колосок образуется на боковой или верхней части ветки и обычно считается базальной единицей соцветий, специфичной для травы, состоящей из короткой ветки, несущей пару чешуек и неопределенное количество цветков. SM также показывает детерминированную или неопределенную судьбу у разных видов трав (Coen and Nugent, 1994; Itoh et al., 2005; Кобаяши и др., 2010; Бартлетт и Томпсон, 2014). У видов с неопределенным SM, таких как пшеница ( Triticum aestivum ), судьба SM сохраняется и продуцируется неопределенное количество FM. У видов, которые дают определенный колоск, таких как кукуруза ( Zea mays ) и рис, SM в конечном итоге трансформируется в конечный FM после производства фиксированного количества боковых FM, таких как два у кукурузы и один в рис, тем самым положив конец судьбе СМ. Сообщалось, что несколько генов регулируют определение SM. LEAFY HULL STERILE1 ( LHS1 ) / OsMADS1 является членом семейства генов E-класса факторов транскрипции (TF) MADS-бокса и аналогичен генам Arabidopsis SEPALLATA . Согласно «гипотезе выбора гена», LHS1 и его ортологи могут потребоваться для специфического определения продукции терминальной меристемы у определенных видов SM (Prasad et al., 2001, 2005; Malcomber and Kellogg, 2004; Zahn et al. ., 2005; Хандай и др., 2013). SUPERNUMERARY BRACT ( SNB ) и OsINDETERMINATE SPIKELET1 ( OsIDS1 ) — это APETALA2 ( AP2 ) — , как и TF, которые необходимы для правильного выбора времени перехода от SM к FM. Мутация SNB вызывает дифференциацию ряда рудиментарных чешуек, дополнительных лемм / палеоподобных органов и даже дополнительных цветков, что подразумевает частичную потерю детерминации SM. Одиночный мутант osids1 демонстрирует слабый фенотип, тогда как двойной мутант snb + osids1 демонстрирует более тяжелый фенотип, чем у одиночного мутанта snb , что позволяет предположить, что OsIDS1 функционирует синергетически с SNB в регуляция определения SM (Lee et al., 2007; Ли и Ан, 2012). Кроме того, MULTI FLORET SPIKELET1 ( MFS1 ) кодирует белок AP2, участвующий в определении судьбы SM у риса. Мутант mfs1 обнаруживает задержанный переход SM-to-FM, что приводит к развитию дополнительного леммоподобного органа или лишнего цветочка (Ren et al., 2013). Следовательно, регуляция судьбы SM отличается от таковой у BM у трав и IM у других видов, и механизм остается в значительной степени неясным.

    На основе генетических и молекулярных исследований цветочных гомеозных мутантов у эвдикотов, таких как Arabidopsis и Antirrhinum majus , модель ABC и пересмотренные модели ABCE были предложены для выяснения молекулярного механизма спецификации органов цветков, в которых A- , Гены класса B, C и E кооперативно регулируют идентичность четырех оборотов цветковых органов (Coen and Meyerowitz, 1991; Coen and Nugent, 1994; Ohmori et al., 2009). Модель ABCE также в значительной степени применима к рису.Геном риса содержит четыре гена A-класса, три гена B-класса, два гена C-класса и по крайней мере пять генов E-класса, некоторые из которых имеют консервативную функцию со своими ортологами ABCE у Arabidopsis, например A- класс APE1 -подобный ген OsMADS15 , B-класс AP3 -подобный ген OsMADS16 , B-класс PISTILLATA- подобные гены OsMADS2 и OsMADS4 , C-класс AGAMOUS ( AG ) -подобные гены OsMADS3 и OsMADS58 , а также ген E-класса LHS1 / OsMADS1 (Jeon et al., 2000; Нагасава и др., 2003; Ямагути и др., 2006; Yao et al., 2008; Wang et al., 2010; Дрени и др., 2011; Hu et al., 2011). Однако, в отличие от эвдикота, такого как Arabidopsis, на цветке риса образуется специализированная внешняя мутовка цветочных органов (lemma и palea). В дополнение к генам класса A и E, таким как OsMADS15 и LHS1 / OsMADS1 , было установлено, что многие другие гены регулируют развитие леммы и / или палеи. STAMENLESS1 , THIAMINE REQUIRING1 ( Th2 ) и , СОХРАНЯЕМЫЕ В ЦИЛИРОВАННЫХ ВИДАХ И НА ЗЕМЕЛЬНЫХ РАСТЕНИЯХ, 2009; Ли и др., 2012; Ян и др., 2015; Чжэн и др., 2015). МОЗАИНЫЕ ЦВЕТОЧНЫЕ ОРГАНЫ1 ( MFO1 ) / OsMADS6 и ХИМЕРНЫЕ ЦВЕТОЧНЫЕ ОРГАНЫ1 ( CFO1 ) / OsMADS32 специфически регулируют краевую область развития палеа (mrp) (Ohmori et al., 2009; Ohmori et al., 2009; Ohmori et al., 2009; др., 2010; Sang et al., 2012). У мутантов mfo1 и cfo1 развитие mrp серьезно нарушено и приводит к леммоподобным палеа. Напротив, в депрессивном palea1 ( dp1 ) тело palea (bop) деградировано так, что остаются только два mrps, что указывает на то, что DP1 функционирует в развитии bop (Luo et al., 2005; Jin et al., 2011).

    Репрессоры транскрипции и их корепрессоры играют решающую роль в развитии цветков растений (Liu and Karmarkar, 2008; Krogan and Long, 2009). TPL / TPR, консервативное семейство белков-корепрессоров транскрипции растений, подавляют экспрессию целевого гена путем взаимодействия с ТФ, которые содержат мотивы амфифильных (EAR), связанных с этилен-зависимым элементом, связывающим фактор связывания (LxLxL / DLNxxP), после чего гистоновые деацетилазы (HDACs) ) рекрутируются в комплексы транскрипции, и состояние хроматина изменяется с активного на неактивное (Long et al., 2006; Гонсалес и др., 2007; Кроган и Лонг, 2009). У арабидопсиса TPL и четыре белка TPR (TPR1, TPR2, TPR3 и TPR4) действуют избыточно в развитии арабидопсиса. Молчание TPR2 у четверного мутанта tpl tpr1 tpr3 tpr4 приводит к дефектному эмбриональному развитию, аналогичному таковому у мутанта tpl 1 (Long et al., 2002, 2006). Для риса известны три члена семейства корепрессоров TPL / TPR: OsTPR1 , OsTPR2 / ABERRANT SPIKELET AND PANICLE1 ( ASP1 ) и OsTPR3 . ASP1 действует как транскрипционный корепрессор для репрессии генов, которые регулируют детерминированность и поддержание BM, IM и SM (Yoshida et al., 2012), тогда как о функциях двух OsTPRs не сообщалось. Ген A-функции Arabidopsis AP2 действует как репрессор и взаимодействует с корепрессорным комплексом TPL-HDAC19, чтобы ограничить экспрессию гена C-функции AG в оборотах 1 и 2 (Ó’Maoiléidigh et al., 2014). У риса NONSTOP GLUME1 (NSG1) взаимодействует с OsTPR через мотив EAR, подавляя экспрессию OsMADS1 в рудиментарной чешуе, стерильной чешуе и mrp за счет повышенного ацетилирования гистона h4 в целевой области (Zhuang et al., 2020). Однако идентичность факторов, которые взаимодействуют с OsTPRs, чтобы регулировать развитие цветков и соцветий у риса, и задействованный механизм остаются неясными.

    ТФ семейства MYB присутствует почти на всех заводах. Члены этого семейства содержат три типа консервативных ДНК-связывающих доменов MYB, а именно R1, R2 и R3. Основываясь на количестве повторов домена MYB, белки MYB можно классифицировать как R2R3-MYB, 1R-MYB, 3R-MYB и 4R-MYB (Dubos et al., 2010). У риса несколько генов MYB играют важную роль в развитии органов.Гены OsGAMYB , ANTHER INDEHISCENCE1 и CARBON STARVED ANTHER преимущественно регулируют развитие пыльцы (Kaneko et al., 2004; Zhu et al., 2004, 2015; Zhang et al., 2010) и SHALLOT LIKE1 ( SLL1 ) влияет на форму листа и корпуса (Zhang et al., 2009; Ren et al., 2019). Однако остается неясным, как гены MYB регулируют развитие риса. В этом исследовании мы идентифицировали TF MYB в рисе под названием MFS2 . Мутация mfs2 вызывает аномальную спецификацию идентичности палеи и частичную потерю детерминации колосков. MFS2 , как было указано, является репрессором транскрипции с высокой активностью благодаря двум типичным мотивам EAR, один из которых расположен на С-конце и взаимодействует с тремя белками TPL / TPR риса. Таким образом, наши результаты показали, что MFS2 играет решающую роль в регуляции идентичности цветочных органов и детерминированности SM у риса, образуя репрессивный комплекс с белками TPL / TPR для ограничения экспрессии нижестоящих генов.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Плейотропные дефекты в

    mfs2 Колоск

    У риса соцветие и развитие колосков подразделяются на стадии от In1 до In9 и от Sp1 до Sp8, соответственно (Ikeda et al., 2004). В этом исследовании мы идентифицировали рецессивный мутант mfs2 , который связан с развитием рисового колоска и органов цветков. Морфологии цветков мутанта mfs2 и дикого типа сравнивали на стадии In9 (стадия заголовка).

    Как правило, типичный колоск дикого типа состоит из двух рудиментарных чешуек, двух стерильных чешуек и одного конечного цветочка, содержащего четыре оборота цветочных органов: нижнюю чешуйку и палеу на первом обороте, а также две лодикулы, шесть тычинок и один пестик. расположены последовательно во внутренних трех оборотах (рис.1, A1 – A7). В дополнение к немного большему размеру леммы, палеа можно отличить от леммы по нескольким характеристикам, таким как количество сосудистых пучков и отчетливая маргинальная область. В лемме было пять сосудистых пучков, а в палеа — три сосудистых пучка. Palea можно рассматривать как комбинационный орган из двух частей: bop и mrp. Хотя боп был анатомически подобен лемме, с четырьмя различимыми клеточными слоями (силикатированный абаксиальный эпидермис, фиброзная склеренхима, губчатые паренхиматозные клетки и не силикатизированный адаксиальный эпидермис), mrp демонстрировал гладкий не кремнеземистый абаксиальный эпидермис, большое количество губчатая паренхиматозная ткань и небольшое количество клеток склеренхимы (рис.1, A1 и A4 – A7, а также 2, A и B). Две лодикулы представляли собой небольшие полупрозрачные органы правильной формы легкого, сформированные асимметрично внутренней из двух лемм (рис. 1, A6 и A7), и состояли из паренхиматозных клеток и нескольких вкрапленных элементов трахеи (рис. 2C).

    Рисунок 1.

    Фенотипы колосков дикого типа и mfs2 . A1, Полный колоск дикого типа. A2, Колосок из A1 без леммы (le). A3, Колосок из A1 без леммы и palea (pa).A4, Поверхность колоска дикого типа. A5 и A6, поверхностные символы le, lodicule (lo), bop и mrp соответственно. A7, Поперечные срезы колоска дикого типа. B1, mfs2 колоск с деградированной палеей (dp). B2 и B3, Колосок без леммы и палеи. B4 и B5 — Поверхности деградированной чешуи и лишней чешуи соответственно. B6, увеличение B5. B7, Поверхность органа слияния тычинок и пестиков (sp). B8, Поперечные срезы колоса mfs2 с деградированной палеей.C1, mfs2 колоск с частично леммоподобным палеа (lp). C2 и C3, Колосок без леммы и палеи. C4 и C5, Поверхности частично леммоподобной палеи и дополнительной чешуи соответственно. C6, Поперечные срезы колоса mfs2 с частично похожей на лемму палеей. D1, mfs2 колоск с леммоподобной палеей. D2, Колосок из D1 без леммы и леммоподобной палеи. D3, колоск из D2 с удаленным лишним палеа / mrp-подобным органом. D4 и D5, Поверхности леммоподобной палеи и дополнительной чешуи соответственно.D6, Поперечные срезы колоса mfs2 с леммоподобной палеей. E, схематические диаграммы структуры колосков дикого типа (WT) и mfs2 в поперечном сечении. ep, Extra palea / mrp-подобный орган; пи, пестик; sl, стерильная лемма; ул, тычинка. Масштабные линейки = 1 мм (A1 – A3, B1 – B3, C1 – C3 и D1– D3), 200 мкм (A4 – A6, B4– B7, C4, C5, D4 и D5) и 500 мкм (A7 , B8, C6 и D6).

    Рисунок 1.

    Фенотипы колосков дикого типа и mfs2 . A1, Полный колоск дикого типа.A2, Колосок из A1 без леммы (le). A3, Колосок из A1 без леммы и palea (pa). A4, Поверхность колоска дикого типа. A5 и A6, поверхностные символы le, lodicule (lo), bop и mrp соответственно. A7, Поперечные срезы колоска дикого типа. B1, mfs2 колоск с деградированной палеей (dp). B2 и B3, Колосок без леммы и палеи. B4 и B5 — Поверхности деградированной чешуи и лишней чешуи соответственно. B6, увеличение B5. B7, Поверхность органа слияния тычинок и пестиков (sp).B8, Поперечные срезы колоса mfs2 с деградированной палеей. C1, mfs2 колоск с частично леммоподобным палеа (lp). C2 и C3, Колосок без леммы и палеи. C4 и C5, Поверхности частично леммоподобной палеи и дополнительной чешуи соответственно. C6, Поперечные срезы колоса mfs2 с частично похожей на лемму палеей. D1, mfs2 колоск с леммоподобной палеей. D2, Колосок из D1 без леммы и леммоподобной палеи. D3, колоск из D2 с удаленным лишним палеа / mrp-подобным органом.D4 и D5, Поверхности леммоподобной палеи и дополнительной чешуи соответственно. D6, Поперечные срезы колоса mfs2 с леммоподобной палеей. E, схематические диаграммы структуры колосков дикого типа (WT) и mfs2 в поперечном сечении. ep, Extra palea / mrp-подобный орган; пи, пестик; sl, стерильная лемма; ул, тычинка. Масштабные линейки = 1 мм (A1 – A3, B1 – B3, C1 – C3 и D1– D3), 200 мкм (A4 – A6, B4– B7, C4, C5, D4 и D5) и 500 мкм (A7 , B8, C6 и D6).

    Рисунок 2.

    Гистологический анализ и анализ обратной транскрипции (RT) -qPCR органов в колосках дикого типа (WT) и мутанта mfs2 . A, Поперечный разрез сустава леммы (le) и палеа (pa) в колосках дикого типа. B, поперечный срез mrp дикого типа. C, увеличение lodicule дикого типа (lo). D, Поперечные сечения леммы и леммоподобного палеа (lp) в mfs2 . E, поперечный разрез деградированной палеи (dp). F, поперечный разрез дополнительной чешуи.G к I, относительная экспрессия OsMADS1 , DL и OsMADS6 в органах колосков дикого типа (синий) и mfs2 (оранжевый), соответственно. ep, Extra palea / mrp-подобный орган. Масштабные линейки = 100 мкм.

    Рисунок 2.

    Гистологический анализ и анализ обратной транскрипции (RT) -qPCR органов в колосках дикого типа (WT) и мутанта mfs2 . A, Поперечный разрез сустава леммы (le) и палеа (pa) в колосках дикого типа. B, поперечный срез mrp дикого типа.C, увеличение lodicule дикого типа (lo). D, Поперечные сечения леммы и леммоподобного палеа (lp) в mfs2 . E, поперечный разрез деградированной палеи (dp). F, поперечный разрез дополнительной чешуи. G к I, относительная экспрессия OsMADS1 , DL и OsMADS6 в органах колосков дикого типа (синий) и mfs2 (оранжевый), соответственно. ep, Extra palea / mrp-подобный орган. Масштабные линейки = 100 мкм.

    Колоски mfs2 показали плейотропные дефекты в палеа и внутренних органах цветка.Согласно статистическому анализу 100 колосков, выбранных случайным образом из 10 mfs2 метелок, палеа трансформировалась в леммоподобные органы в ~ 57% колосков, а деградированные палеа наблюдались в 29% колосков (дополнительный рисунок S1). На основании фенотипа палеа mfs2 колосков были разделены на два типа: колоски с деградированной палеей (тип I; рис. 1E) и колоски с леммоподобной палеей (тип II; рис. 1E).

    В колосках I типа деградировавшая палеа показывала уменьшенное значение БП, некоторые из которых остались только двумя структурами МРП (рис.1, B1, B4, B8 и 2E). Эти mrps обычно были более широкими и включали больше подобных сосудистым пучкам элементов, чем у дикого типа, и утратили фиксацию крючковой структуры с помощью леммы (Figs. 1B8 и 2E). Наблюдались обдирание lemma и palea, дополнительные palea / mrp-подобные органы и другие дефекты трех внутренних оборотов органов. Из исследованных колосков типа I около 35% содержали дополнительный палеа / mrp-подобный орган в обороте 2. Большинство этих органов имели mrp-подобный вид с гладким эпидермисом (рис.1, B3, B5, B6 и B8). Кроме того, почти 35% представителей типа I имели увеличенное количество тычинок, а около 30% включали увеличенное количество пестиков (дополнительный рисунок S1). Более того, в ~ 4% колосков органы слияния тычинки и пестика наблюдались на третьем обороте, который демонстрировал рыльце, развитое на пыльнике (Рис. 1, B2 и B7; Дополнительный Рис. S1).

    Отличительной особенностью колосков II типа было то, что палеа трансформировалась в леммоподобные органы и увеличивалось количество внутренних органов цветка (рис.1, C1 и D1). В части этих колосков палеа были больше и содержали пять сосудистых пучков, подобных лемме, но сохраняли чрезвычайно узкую mrp с гладким эпидермисом (рис. 1, C4 и C6). У остальных колосков палеа полностью трансформировалась в орган, подобный лемме, и развились четыре клеточных слоя, идентичные таковым у леммы (рис. 1, D4, D6 и 2D). Примечательно, что около 91% колосков типа II развили две дополнительные палеа / mrp-подобные структуры в обороте 2, каждая из которых состояла из двух латеральных mrp-подобных структур с гладким эпидермисом и одной узкой медиальной боп-подобной ткани с силикатизированной адаксиальный эпидермис с трихомами и выступами, очень похожими на деградированные палеи колосков I типа (рис.1, C2, C3 и D2; Дополнительный рис. S1). Неудивительно, что четыре лодикулы всегда прикреплялись к дополнительным палеа / mrp-подобным структурам на обороте 2 (хотя они часто имели неправильную форму), с повышенным количеством тычинок, обычно наблюдаемым на третьем обороте, и иногда увеличенным количеством пестиков, наблюдаемых в оборот 4 (рис. 1, C5, C6, D3, D5, D6 и 2F). Следовательно, колоски типа II обычно содержат две леммы (исходную лемму и леммоподобную палею), два палеа / mrp-подобных органа, две пары лодикул и увеличенное количество тычинок и пестиков, что в значительной степени привело к образованию «Двухцветок» и частичная потеря детерминированности SM у мутанта mfs2 (рис.1, C6, D6 и E).

    Далее мы обнаружили уровни экспрессии генов идентичности lemma и / или palea DROOPING LEAF ( DL ), OsMADS1 и OsMADS6 в родственных органах дикого типа и мутанта mfs2 (рис. 2, G – I). В леммоподобных палеасах были обнаружены высокий уровень экспрессии DL и OsMADS1 и низкий уровень экспрессии OsMADS6 , которые были чрезвычайно похожи на паттерны экспрессии, обнаруженные в лемме дикого типа.Этот результат наводил на мысль, что леммоподобные палитры обычно принимали тождество, подобное лемме. В деградированных палеоэпиляциях уровни транскриптов DL и OsMADS6 были подобны таковым в палеоэпиляциях дикого типа, тогда как транскрипция OsMADS1 была существенно подавлена, что согласуется с фенотипом деградации bop. В дополнительных чешуях был обнаружен высокий уровень экспрессии OsMADS1 , хотя уровень был немного ниже, чем в палео дикого типа; уровень экспрессии OsMADS6 был существенно выше, чем обнаруженный в палеоэпиляциях дикого типа, а экспрессия DL была обнаружена на низком уровне, аналогичном таковому в палеоэпиляциях дикого типа.Эти результаты предполагали, что дополнительные чешуйки приобрели палеоподобную идентичность.

    Аномальное раннее развитие колосков в

    mfs2 Мутант

    Раннее развитие рисового колоска было сложным, но хорошо организованным процессом. С помощью сканирующей электронной микроскопии мы наблюдали заметные различия в раннем развитии колосков между мутантом mfs2 и диким типом на стадиях развития от Sp4 до Sp8. У колосков дикого типа зачаток palea primordium зарождался в положении, противоположном lemma primordium во время стадии Sp4, и lemma primordium была больше, чем palea primordium (рис.3А). На стадиях от Sp5 до Sp8 зачатки лодикул, тычинок и пестика развивались упорядоченным образом. На стадии Sp8 зачатки лемм и палеас были соединены вместе и охватывали внутренние органы цветка (рис. 3, B – D). В колосках mfs2 морфологические различия наблюдались начиная со стадии Sp4. У некоторых колосков на стадии Sp4 образовались более мелкие палея-зачатки, чем у колосков дикого типа (рис. 3Е). Процесс развития palea primordium был медленнее, чем у palea primordium дикого типа.Деградировавшая палея потеряла способность цепляться за лемму на стадии Sp8 (рис. 3, F – H). Часто наблюдалось, что некоторые зачатки палеа были крупнее, чем у дикого типа на той же стадии, и быстро удлинялись после стадии Sp4, что демонстрировало сходство с развитием зачатков леммы. На стадии Sp8 аномальные зачатки палеа были похожи на зачатки леммы как по форме, так и по размеру (рис. 3, I – L). Эти результаты подтверждают, что идентичность палеи затрагивается на ранней стадии развития у мутанта mfs2 .Кроме того, дополнительные palea / mrp-подобные зачатки и увеличенные зачатки тычинок наблюдались у некоторых колосков мутанта mfs2 (Рис. 3, F, G и J).

    Рисунок 3.

    Сканирующие электронные микрофотографии колосков дикого типа и mfs2 на ранних стадиях развития. От A до D, колоски дикого типа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8 соответственно. E-H, mfs2 колосков с деградировавшими зачатками палеа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8 соответственно.I — L, mfs2 колосков с леммоподобными палеа зачатками на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8 соответственно. ep, Extra palea / mrp-подобный орган; ле, лемма; lp — леммоподобная палеа; па, палеа; пи, пестик; sl, стерильная лемма; *, тычинка. Масштабные линейки = 200 мкм.

    Рисунок 3.

    Сканирующие электронные микрофотографии колосков дикого типа и mfs2 на ранних стадиях развития. От A до D, колоски дикого типа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8 соответственно.E-H, mfs2 колосков с деградировавшими зачатками палеа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8 соответственно. I — L, mfs2 колосков с леммоподобными палеа зачатками на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8 соответственно. ep, Extra palea / mrp-подобный орган; ле, лемма; lp — леммоподобная палеа; па, палеа; пи, пестик; sl, стерильная лемма; *, тычинка. Масштабные линейки = 200 мкм.

    Паттерны экспрессии генов идентичности цветочных органов на ранних стадиях цветочного развития

    Чтобы подтвердить аномальное развитие органов цветка у мутанта mfs2 , уровни экспрессии генов, которые регулируют идентичность палеа и других органов цветка, были обнаружены с помощью количественной ПЦР (qPCR; дополнительный рис.S2), включая DL , OsMADS1 , OsMADS2 , OsMADS6 , OsMASD32 , REP1 , CCP1 , Th2 , Ah3 и DP1 . В мутанте mfs2 уровни экспрессии OsMADS6 , REP1 и Th2 были резко подавлены, тогда как уровни экспрессии OsMADS1 , OsMADS2 , DL и DP1 были существенно повышены, будучи согласуется с дефектами палеи и других органов цветка.

    Гибридизацию in situ использовали для исследования паттернов экспрессии OsMADS1 , OsMADS6 , OsMADS2 и DL . Во время стадий от Sp4 до Sp8 у колосков дикого типа OsMADS1 в основном экспрессируется во всей лемме и бопе, но не в mrp (Fig. 4, G1 – G3). В колосках типа II mfs2 , за исключением леммы, экспрессия OsMADS1 была обнаружена во всей леммоподобной палеа (как mrp, так и bop), а также в дополнительных палеа / mrp-подобных органах (рис.4, I1 – I3). У колосков I типа, помимо леммы, в деградированных бопах был обнаружен сигнал OsMADS1 (рис. 4, h2 – h4). В колосках дикого типа OsMADS6 экспрессируется в цветочной меристеме во время стадий Sp4 и Sp5 и впоследствии экспрессируется преимущественно в зачатках mrp и lodicule во время стадий Sp6-Sp8 (Fig. 4, A1-A3). В колосках mfs2 типа I экспрессия OsMADS6 была в некоторой степени репрессирована в mrps деградированных палеа, но не было обнаружено заметных различий в других доменах по сравнению с доменами колосков дикого типа (рис.4, Б1 – Б3). Как и ожидалось, в колосках типа II mfs2 почти не было обнаружено сигнала для OsMADS6 во всей леммоподобной палеа (рис. 4, C1 – C3), тогда как отчетливый сигнал наблюдался в краевых областях. дополнительных палеоподобных органов. Экспрессия DL была впервые обнаружена в лемме дикого типа во время стадий Sp4 и Sp5, а также в леммах и пестике после стадии Sp6, когда зачаток пестика был инициирован (рис. 4, D1 – D3). В колосках mfs2 не было обнаружено сигнала DL в уменьшенной палеа и экстрапалеоподобных органах (рис.4, E1 – E3), тогда как DL эктопически экспрессировался в леммоподобных палеях с момента своего зарождения (рис. 4, F1 – F3). Таким образом, в леммоподобных палеасах мутанта mfs2 паттерны экспрессии OsMADS1 и DL были аналогичны таковым из леммы дикого типа, тогда как экспрессия OsMADS6 была существенно снижена, что подтвердило, что эти органы приобрели идентичность, подобную лемме. Экспрессия OsMADS1 и OsMADS6 в дополнительном палеа / mrp-подобном органе также указывала на то, что это были палеа-подобные органы.У дикого типа OsMADS2 преимущественно экспрессируется в лодикулах и тычинках. В колоске mfs2 типа II была обнаружена сильная экспрессия OsMADS2 в четырех лодикуло-подобных органах, которые обычно были связаны с краем дополнительных палеа / mrp-подобных органов (дополнительный рисунок S3), что указывает на то, что бывшие органы представлены двумя парами лодикул.

    Рисунок 4.

    Паттерн экспрессии генов идентичности цветочных органов в колосках дикого типа и mfs2 мутант.От A1 до A3, экспрессия OsMADS6 в колосках дикого типа (WT) на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. B1-B3, экспрессия OsMADS6 в mfs2 колосках с деградированной палеей (dp) на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. C1-C3, экспрессия OsMADS6 в mfs2 колосках с леммоподобным палеа (lp) на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. D1-D3, экспрессия DL в колосках дикого типа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8.E1 – E3, экспрессия DL в mfs2 с деградированными колосками на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. От F1 до F3, экспрессия DL в mfs2 колосков с леммоподобным палеа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. G1-G3, экспрессия OsMADS1 в колосках дикого типа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. h2 to h4, экспрессия OsMADS1 в mfs2 с деградированными колосками на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8.От I1 до I3, экспрессия OsMADS1 в mfs2 колосках с леммоподобным палеа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. ep, Extra palea / mrp-подобный орган; ле, лемма; вот, lodicule; па, палеа; пи, пестик; sl, стерильная лемма; sp, орган сращения тычинок и пестиков. Масштабные линейки = 100 мкм.

    Рисунок 4.

    Паттерн экспрессии генов идентичности цветочных органов в колосках дикого типа и мутанте mfs2 . От A1 до A3, экспрессия OsMADS6 в колосках дикого типа (WT) на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8.B1-B3, экспрессия OsMADS6 в mfs2 колосках с деградированной палеей (dp) на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. C1-C3, экспрессия OsMADS6 в mfs2 колосках с леммоподобным палеа (lp) на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. D1-D3, экспрессия DL в колосках дикого типа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. E1 – E3, экспрессия DL в mfs2 с деградированными колосками на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8.От F1 до F3, экспрессия DL в mfs2 колосков с леммоподобным палеа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. G1-G3, экспрессия OsMADS1 в колосках дикого типа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. h2 to h4, экспрессия OsMADS1 в mfs2 с деградированными колосками на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8. От I1 до I3, экспрессия OsMADS1 в mfs2 колосках с леммоподобным палеа на стадиях развития Sp4, Sp5, Sp6, Sp7 и Sp8.ep, Extra palea / mrp-подобный орган; ле, лемма; вот, lodicule; па, палеа; пи, пестик; sl, стерильная лемма; sp, орган сращения тычинок и пестиков. Масштабные линейки = 100 мкм.

    Кроме того, мы обнаружили экспрессию OsIDS1 , SNB и MFS1 , которые функционируют в регуляции детерминации SM на ранних стадиях развития (Lee and An, 2012; Ren et al., 2013). В то время как MFS1 был слегка повышен, OsIDS1 и SNB явно подавлялись в молодых метелках мутанта mfs2 (дополнительный рис.S4). Эти результаты свидетельствуют о том, что активность SM продлевается и приводит к развитию дополнительного органа цветка и даже цветков у мутанта mfs2 из-за мутации MFS2 , препятствующей транскрипции OsIDS1 и SNB .

    Клонирование на основе карты

    MFS2

    Мутант mfs2 был скрещен со стерильной линией cv Xinong 1A. Все гибриды F1 демонстрировали фенотип дикого типа, тогда как потомство F2 демонстрировало сегрегацию фенотипов дикого типа и мутантных фенотипов в соответствии с соотношением 3: 1 (χ 2 = 2.57 <χ 2 0,05 = 3,84), что указывает на то, что мутантный признак контролируется одним рецессивным геном. В качестве популяции для картирования использовали в общей сложности 1464 человека, проявляющих мутантный фенотип в потомстве F2. Ген MFS2 был картирован в длинном плече хромосомы 4 в области ~ 1,02 Mb между простыми маркерами повтора последовательности RM17349 и RM17391. В отображаемой области был TF семейства MYB ( LOC _ Os04g47890 ).Анализ последовательности идентифицировал однонуклеотидную делецию (C) в открытой рамке считывания Os04g47890 у мутанта, которая вызвала мутацию сдвига рамки считывания из 198-го кодона и преждевременное прекращение трансляции в 213-м кодоне (фиг. 5A). Чтобы подтвердить эти наблюдения, комплементарный вектор, который содержал кодирующую последовательность LOC _ Os04g47890 (3413 п.н.), последовательность длиной 2282 п.н. перед стартовым кодоном и последовательность 1037 п.н. ниже стоп-кодона был преобразован в последовательность mfs2 мутант.Всего было получено 17 трансгенных растений, у девяти из которых мутантный фенотип был спасен по сравнению с фенотипом колосков дикого типа (фиг. 5B). Кроме того, мы сконструировали вектор интерференции РНК (RNAi) с использованием фрагмента длиной 161 п.н. из LOC _ Os04g47890 комплементарной ДНК (кДНК) и трансформировали вектор в вектор japonica cv Zh21, чтобы заглушить LOC _ Os04g47890 (дополнительный рисунок S5A). В 13 из 15 полученных трансгенных растений анализ кПЦР показал, что уровень транскрипта MFS2 был снижен в различной степени (дополнительный рис.S5C). Эти линии RNAi обнаруживают сходные плейотропные дефекты колосков с таковыми у mfs2 мутантных колосков, содержащих леммоподобные палеа, деградированные палеа и дополнительный палеаподобный орган (Supplemental Fig. S5B). Взятые вместе, эти результаты показали, что LOC _ Os04g47890 был геном MFS2 .

    Рисунок 5.

    Клонирование MFS2 на основе карты. A, точное отображение MFS2 . B, Генетическая комплементация mfs2 .WT, дикий тип. Масштабные линейки = 1000 мкм.

    Рисунок 5.

    Клонирование MFS2 на основе карты. A, точное отображение MFS2 . B, Генетическая комплементация mfs2 . WT, дикий тип. Масштабные линейки = 1000 мкм.

    Пространственно-временная картина экспрессии

    MFS2

    Для определения пространственно-временного характера экспрессии MFS2 мы использовали кПЦР и гибридизацию in situ для изучения экспрессии MFS2 в растениях дикого типа.Анализ qPCR показал, что MFS2 был высоко экспрессирован в молодых метелках, тогда как его транскрипты были чрезвычайно низкими в стебле, листе, влагалище и побеге и даже не обнаруживались в корне (рис. 6А). Гибридизация in situ показала, что слабое накопление мРНК MFS2 впервые было обнаружено в BM (фиг. 6B). Впоследствии сильные сигналы MFS2 были обнаружены в SM (рис. 6C). При инициировании зачатков органов цветков транскриптов MFS2 были обнаружены в FM и зачатках стерильных lemma, lemma и palea (рис.6, Г – Ж). Впоследствии MFS2 экспрессировался в лодикуле, тычинке и пестике (Fig. 6, G – I). Этот паттерн экспрессии соответствовал фенотипу mfs2 .

    Рисунок 6.

    Шаблон выражения MFS2 . A, Экспрессия MFS2 в различных тканях риса (вегетативные органы отмечены коричневым цветом; репродуктивные органы отмечены красным). B к I, гибридизация in situ в метелках и колосках дикого типа с использованием антисмыслового зонда MFS2 .B, молодая метелка (<0,5 см длины). C и D, Колосок в точках от Sp1 до Sp2. E и F, Колосок в Sp4. G и H, Колосок в Sp6 и Sp7. Я, Колосок в Sp8. fm, Цветочная меристема; ле, лемма; па, палеа; пи, пестик; sl, стерильная лемма; *, тычинка. Масштабные линейки = 100 мкм.

    Рисунок 6.

    Шаблон выражения MFS2 . A, Экспрессия MFS2 в различных тканях риса (вегетативные органы отмечены коричневым цветом; репродуктивные органы отмечены красным). B к I, гибридизация in situ в метелках и колосках дикого типа с использованием антисмыслового зонда MFS2 .B, молодая метелка (<0,5 см длины). C и D, Колосок в точках от Sp1 до Sp2. E и F, Колосок в Sp4. G и H, Колосок в Sp6 и Sp7. Я, Колосок в Sp8. fm, Цветочная меристема; ле, лемма; па, палеа; пи, пестик; sl, стерильная лемма; *, тычинка. Масштабные линейки = 100 мкм.

    MFS2 Кодирует ядерно-локализованный репрессор транскрипции MYB

    MFS2 кодирует белок MYB 1R-типа из 306 аминокислот с одной повторяющейся единицей MYB. Родственные MYB белки подразделяются на пять подсемейств: CCA1-подобные, I-box-подобные, TRF-подобные, CPC-подобные и TBP-подобные (Chen et al., 2006). Используя белки из риса, Arabidopsis и Amborella trichopoda , филогенетический анализ показал, что была сформирована MFS2 / SLL1-подобная клады, содержащая MFS2 , SLL1 (известный ген скручивающегося листа риса), несколько дополнительных гомеологов риса и их ортологи у Arabidopsis и A . trichopoda , независимо от CCA1-подобных, I-box-подобных, TRF-подобных, CPC-подобных и TBP-подобных клад (рис. 7A). Кроме того, было построено филогенетическое дерево MFS2-подобных ортологов, содержащее 28 генов от 23 эвдикотов и однодольных.MFS2-подобные гены эвдикотов и однодольных состоят из большой ветви, соответственно, а гены видов трав составляют подветвь, независимую от генов однодольных (дополнительный рис. S6). Таким образом, эволюция MFS2 -подобных генов соответствовала эволюции цветковых растений.

    Рисунок 7.

    MFS2 кодирует репрессор транскрипции MYB с двумя мотивами EAR. A, Филогенетический анализ древа. Филогенетическое дерево было выполнено с использованием метода объединения соседей, и значения поддержки начальной загрузки, рассчитанные на основе 1000 реплик, даны в узлах ветвления; Белок MFS2 и его гомологичные белки выделены красным.Ос, О . sativa ; At, Arabidopsis; Am, А . trichopoda ; BGIOSGA, аннотация генов 9311 генома. B. Анализ субклеточной локализации белка MFS2. Масштабные линейки = 50 мкм. C. Анализ активации транскрипции MFS2 с использованием двойной системы анализа люциферазы-репортера. VP16, активатор транскрипции, использовали в качестве положительного контроля, а GAL4-BD считали отрицательным контролем.

    Рисунок 7.

    MFS2 кодирует репрессор транскрипции MYB с двумя мотивами EAR.A, Филогенетический анализ древа. Филогенетическое дерево было выполнено с использованием метода объединения соседей, и значения поддержки начальной загрузки, рассчитанные на основе 1000 реплик, даны в узлах ветвления; Белок MFS2 и его гомологичные белки выделены красным. Ос, О . sativa ; At, Arabidopsis; Am, А . trichopoda ; BGIOSGA, аннотация генов 9311 генома. B. Анализ субклеточной локализации белка MFS2. Масштабные линейки = 50 мкм. C. Анализ активации транскрипции MFS2 с использованием двойной системы анализа люциферазы-репортера.VP16, активатор транскрипции, использовали в качестве положительного контроля, а GAL4-BD считали отрицательным контролем.

    Анализ последовательности четырех MFS2-подобных белков, трех SLL1-подобных белков и четырех CCA1-подобных белков показал, что на конце домена MYB присутствует высококонсервативный мотив, который проявляется как последовательность SHLQMYR, SHLQKYR и SHAQK (Y / F) в трех типах белков соответственно (дополнительный рис. S7). Мы слили MFS2 с репортерным геном GFP и экспрессировали слитый белок в протопластах риса.Белок MFS2-GFP был локализован в ядре, тогда как только белок GFP равномерно экспрессировался в цитоплазме и ядре (фиг. 7B). Этот результат показал, что MFS2 был локализованным в ядре белком.

    В дополнение к домену MYB, MFS2 содержал два типичных EAR-мотива LxLxL-типа, расположенных внутри домена MYB и на С-конце, соответственно (дополнительный рис. S8), что обычно считалось признаком репрессоров транскрипции. В мутанте mfs2 одиночная нуклеотидная делеция «C» привела к сдвигу рамки считывания и преждевременно усеченному белку, в котором отсутствовал C-концевой мотив EAR (дополнительный рис.S8). Двойной люциферазный репортерный анализ проводили для исследования транскрипционной активности MFS2. В соответствии с положениями домена MYB (24–76 аминокислот), мотива EAR1 (52–57 аминокислот) и мотива EAR2 (248–253 аминокислоты) мы сконструировали двойные люциферазные векторы для укороченных белков MFS2, включающие MFS2-N (1–23), MFS2-N (1–76), MFS2-N (1–192), MFS2-C (24–306), MFS2-C (76–306), MFS2-C (193 –306), слитые белки MFS2 (1–306), мутантный mfs2 (1–212) и MFS2 (1–306) -VP16. Активность активации транскрипции этих белков измеряли в протопластах риса.Почти все усеченные и полноразмерные белки MFS2, содержащие мотив EAR 1 и / или мотив EAR 2, за исключением мутантного белка mfs2 (1–212), показали значительно более сильную репрессивную активность, чем пустой вектор и MFS2-N (1–23). Однако при использовании мутантного белка mfs2 в качестве эффектора активность люциферазы была существенно увеличена по сравнению с таковой у полноразмерных и всех укороченных белков MFS2, за исключением MFS2-N (1-23). Кроме того, слитый белок MFS2 (1–306) -VP16 также показал отчетливо сниженную одиночную LUC по сравнению с белком VP16 (рис.7C). Следовательно, эти результаты продемонстрировали, что MFS2 действует как репрессор транскрипции, а мутировавший белок mfs2 в значительной степени теряет репрессивную активность, вероятно, отражая отсутствие C-концевого мотива EAR или альтернативное изменение в структуре белка.

    MFS2 взаимодействует с белками TPL / TPR риса

    Хорошо известно, что репрессоры EAR-мотива обычно взаимодействуют с корепрессорами транскрипции TPL / TPR, чтобы регулировать различные процессы развития у растений.Поэтому был проведен дрожжевой двугибридный анализ (Y2H) для проверки взаимодействия полноразмерного MFS2, усеченных белков и мутированного белка mfs2 с тремя белками TPL / TPR риса, а именно OsTPR1, OsTPR2 / ASP и OsTPR3. Как и ожидалось, белки MFS2 и mfs2 переменного размера не показали автоактивации (фиг. 8A). Белок MFS2, а также усеченный на С-конце белок MFS2-C (193–306) с мотивом EAR2, показали взаимодействие с любым из трех OsTPR, тогда как N-концевой усеченный белок MFS2-C (1–192) с MYB и EAR motif1, а также белки mfs2, лишенные EAR motif2, не смогли взаимодействовать ни с одним из трех OsTPR (рис.8А). Эти результаты показали, что белок MFS2 продемонстрировал способность взаимодействовать с белками TPL / TPR и что для этого взаимодействия необходим С-концевой мотив EAR.

    Рисунок 8.

    Анализ взаимодействия MFS2 с TPR риса. A, Автоактивация и взаимодействие с TPR1, TPR2 и TPR3 риса MFS2 и его усеченных белков в анализе Y2H, соответственно. B. Анализ взаимодействия MFS2 с TPR1, TPR2 и TPR3 в эпидермальных клетках N . benthamiana листьев в анализе BiFC соответственно.

    Рис. 8.

    Анализ взаимодействия MFS2 с TPR риса. A, Автоактивация и взаимодействие с TPR1, TPR2 и TPR3 риса MFS2 и его усеченных белков в анализе Y2H, соответственно. B. Анализ взаимодействия MFS2 с TPR1, TPR2 и TPR3 в эпидермальных клетках N . benthamiana листьев в анализе BiFC соответственно.

    Мы провели анализ бимолекулярной флуоресценции (BiFC), чтобы определить, взаимодействуют ли MSF2 и OsTPR в листьях Nicotiana benthamiana .Сигнал желтого флуоресцентного белка был обнаружен в ядре эпидермальных клеток N . benthamiana листьев, которые коэкспрессировали слитый белок MFS2-YC с YN-OsTPR1, YN-OsTPR2 или YN-OsTPR3 (фиг. 8B). Этот результат дополнительно подтвердил, что MFS2 способен взаимодействовать с OsTPRs в растительных клетках, что подразумевает, что MFS2 действует как репрессор транскрипции и взаимодействует с родственными корепрессорами.

    ОБСУЖДЕНИЕ

    MFS2 Регулирует развитие Палеа

    В рисовом колоске палеа и лемма вместе охватывают внутренние цветочные органы, формируя и защищая зерно, что имеет большое значение для урожайности и качества риса.Считается, что палеа отличается от леммы как тождественностью, так и происхождением. Палеа считается гомологом профилла (первого листа, образованного пазушной меристемой), тогда как лемма соответствует прицветнику (лист, прилегающий к пазушной меристеме; Kellogg, 2001). Поверхность леммы покрыта силикатными ячейками и заусенцами. В отличие от леммы, палеа — это слитый орган, состоящий из боп и мрп. Bop похож на лемму по форме и структуре, в то время как mrp представляет собой гладкую мембранную структуру, которая может зацепиться с леммой, образуя замкнутую структуру (Ohmori et al., 2009; Ли и др., 2010).

    В этом исследовании мутация MFS2 привела к серьезным дефектам развития палеи. Путем анализа фенотипов и экспрессии маркерных генов мы подтвердили, что в колосках типа I bop был уменьшен, тогда как mrp был более широким или более леммоподобным в разной степени; в колосках типа II боб практически не пострадал, а mrp в значительной степени или полностью приобрело идентичность, подобную лемме, что привело к тому, что вся палитра походила на лемму в целом. Таким образом, потеря функции MFS2 повлияла либо на bop, либо на mrp, что предполагает, что MFS2 играет решающую роль в развитии как bop, так и mrp.Предыдущие исследования показали, что в развитии палеи участвуют несколько генов. LHS1 / OsMADS1 действует как ген E-класса и отвечает за спецификацию леммы и палеи, а его мутация приводит к появлению листоподобной леммы и палеи (Jeon et al., 2000; Prasad et al., 2005 ). Ген Th2 , который кодирует белок DUF640, регулирует размер lemma и palea, а у мутанта th2 развивается меньшая и треугольная lemma и palea (Li et al., 2012). CCP1 / DFO1 , EMBRYONIC FLOWER1 ( EMF1 ) -подобный белок, играет важную роль в развитии палеа, поддерживая опосредованное h4K27me3 эпигенетическое молчание OsMADS58 , эктопическая экспрессия которого вызывает пестикоподобную палею у мутант ccp1 (Yan et al., 2015; Zheng et al., 2015). Было выделено несколько дополнительных генов, которые специфически регулируют развитие только bop или mrp. DP1 кодирует ДНК-связывающий белок AT-hook и регулирует рост bop.У мутанта dp1 боб почти полностью теряется, оставляя два краевых листовых органа (Jin et al., 2011). REP1 принадлежит к семейству генов TCP и предположительно является нижележащим геном DP1 . У мутанта rep1 фенотип слабее, чем у dp1 , и bop сильно снижен, что приводит к существенно меньшему палеа (Yuan et al., 2009). Ah3 кодирует белок домена MYB и играет важную роль в спецификации идентичности bop.У мутанта ah3 боп дегенерирован в разной степени, но mrp не затронут (Ren et al., 2019). В отличие от вышеупомянутых генов, которые регулируют развитие bop, два гена MADS-бокса, MFO1 / OsMADS6 и CFO1 / OsMADS32 , необходимы для определения идентичности mrp. У мутантов mfo1 и cfo1 mrp приобрел все черты леммы, что приводит к преобразованию палеи в лемму (Ohmori et al., 2009; Ли и др., 2010; Sang et al., 2012). Следовательно, посредничество MFS2 при разработке bop аналогично таковому для REP1 , DP1 и Ah3 , тогда как MFS2 определяет идентификатор mrp аналогично тому, как это делается для MFO1 или CFO1 .

    MFS2 Влияет на определение SM

    Судьба SM связана с количеством боковых органов и цветков, образующихся в колоске. У риса дикого типа, когда одна терминальная FM образуется на вершине SM, детерминированный колоск в конечном итоге дает фиксированное количество органов / цветков, содержащих одну пару рудиментарных чешуек, две стерильные чешуи и один цветочек.В этом исследовании большинство колосков типа II колоса mfs2 демонстрировало леммо-подобную палею, четыре дополнительных mrp- / palea-подобных структуры, две пары лодикул и увеличенное количество тычинок и пестиков. Следовательно, этот фенотип означал частичную потерю детерминированности СМ и в значительной степени образование «двухцветков». Точно так же у мутанта mfs1 некоторые колоски содержали дополнительный леммоподобный орган, и в этих колосках количество внутренних органов цветка часто увеличивалось одновременно с деградацией палеи (Ren et al., 2013). У мутанта snb у некоторых колосков появляются лишние рудиментарные чешуйки, дополнительные леммоподобные или палеоподобные структуры или боковые соцветия до того, как появляется последний цветочек. Двойной мутант snb, + ids1 производит ряд дополнительных прицветниковых органов, включая рудиментарные чешуйки, чешуйки или палеи, по сравнению с соответствующими одиночными мутантами (Lee et al., 2007; Lee and An, 2012). В этом исследовании существенное снижение уровня экспрессии SNB и OsIDS1 наблюдалось в молодых метелках мутанта mfs2 , но не было обнаружено четкой разницы в уровнях экспрессии mfs1 между мутантом и диким типом. .Эти результаты подтверждают, что MFS2 может регулировать судьбу SM, чтобы гарантировать правильное время перехода SM-to-FM, влияя на пути SNB и OsIDS1 , но не путь MFS1 .

    MFS2 Действует как репрессор транскрипции

    Комплексы репрессии транскрипции включают репрессор и ко-репрессоры и играют решающую роль в развитии растений. Белки TPL / TPR растений являются консервативными корепрессорами транскрипции в семействе Groucho / Tup1, которые обычно не обладают ДНК-связывающей активностью, но могут взаимодействовать с мотивом EAR TF.Затем комплекс TF-TPL подавляет экспрессию целевого гена, рекрутируя HDAC в транскрипционные комплексы, и состояние хроматина изменяется с активного на неактивное (Long et al., 2006; Gonzalez et al., 2007; Liu and Karmarkar, 2008; Krogan и Лонг, 2009). У Arabidopsis ген A-функции AP2 действует как репрессор, который взаимодействует с корепрессорным комплексом TPL-HDA19 для ограничения экспрессии гена C-функции AG в 1 и 2 оборотах и ​​генов B-функции AP3 и PISTILLATA и ген E-функции SEPALLATA3 в чашелистиках (Ó’Maoiléidigh et al., 2014). Геном риса содержит три белка TPR: OsTPR1 , OsTPR2 и OsTPR3 . Однако имеется мало информации о механизме образования TF-TPR в рисе. Мутация OsTPR2 / ASP1 вызывает неорганизованный паттерн ветвления, удлиненную стерильную лемму и рудиментарные чешуйки (Yoshida et al., 2012). До сих пор функции OsTPR1 и OsTPR3 не выяснены. Недавно NSG1 был идентифицирован как репрессор транскрипции, кодирующий единственный домен цинкового пальца C2h3 и взаимодействующий с OsTPR через свой C-концевой мотив EAR, чтобы регулировать развитие колосков путем ограничения экспрессии OsMADS1 в рудиментарных чешуях и стерильной лемме. (Чжуанг и др., 2020).

    Белок MFS2 содержал два типичных мотива EAR, с мотивом EAR1, расположенным внутри домена MYB, и мотивом EAR2 на С-конце. Двойной анализ люциферазы показал, что белок MFS2 и все усеченные белки с одним или обоими мотивами EAR проявляли сильную репрессивную активность, а анализы Y2H и BIFC показали, что белок MFS2 и усеченные белки с С-концевым мотивом EAR2 взаимодействовали с тремя OsTPR. Таким образом, эти данные предполагают, что MFS2 может демонстрировать механизм, аналогичный NSG1 , т.е.е. взаимодействуя с OsTPR через С-концевой мотив EAR, подавляя экспрессию нижележащих генов, регулируя тем самым развитие колосков у риса. Интересно, что хотя он содержал мотив EAR1, репрессивная активность мутантного белка mfs2 была сильно снижена по сравнению с таковой усеченных белков, содержащих тот же самый мотив EAR1. Мы предположили, что это различие в основном связано с разными структурами белков. Из-за присутствия более длинного С-конца, мотив EAR1 в белке mfs2 может быть недоступен для взаимодействия с белками TPR и проявления репрессивной активности, тогда как мотив EAR1 может быть экспонирован в усеченных белках MFS2-N (1–76 ) и MFS2-N (1–192), чтобы проявлять отчетливую репрессивную активность.Следовательно, эти результаты предполагают, что в клетках колосков риса, поскольку домен MYB, несущий мотив EAR1, отвечает за связывание ДНК, мотив EAR2 в белке MFS2 может быть ответственным за взаимодействие с OsTPRs для репрессии генов-мишеней. Идентификация прямых мишеней MFS2 еще больше улучшит наше понимание его функции и механизма в развитии колосков у риса и других видов трав.

    ЗАКЛЮЧЕНИЕ

    В этом исследовании мы идентифицировали мультифлорный мутант mfs2 .Колоски mfs2 демонстрировали деградированную / похожую на лемму палею, а также увеличенное количество палеа / мрп-подобных органов и других внутренних оборотных органов цветков. Структура колосков подразумевала, что мутация MFS2 привела к частичной потере детерминированности SM и тенденции к образованию двух цветков в одном колоске. MFS2 кодировал белок MYB 1R-типа, который содержит домен MYB и два мотива EAR, и проявлял сильную репрессивную активность. MFS2 был способен взаимодействовать с тремя корепрессорами OsTPR через С-концевой мотив EAR.Эти данные указывают на то, что MFS2 действует как репрессор для регуляции идентичности цветочных органов и детерминации SM у риса.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Растительные материалы

    В этом исследовании мутант mfs2 был естественным мутантом, а сорт Jinhui 10 (сорт J10; Oryza sativa ssp. Indica) использовали в качестве дикого типа. Как мутант mfs2 , так и cv J10 были потомками сорта Luhui 1089 (cv Lh2089), линии-восстановителя гибридного риса.cv J10 является линией-реставратором с ориентированным генетическим улучшением cv Lh2089, полученным с помощью обратного скрещивания нашей группой, и мутант mfs2 был идентифицирован из поколения передового обратного скрещивания. Таким образом, мутант mfs2 имеет генетический фон, очень похожий на генетический фон cv J10. Поэтому в качестве дикого типа мы использовали cv J10, но не cv Lh2089.

    Все растительные материалы были выращены на экспериментальных полях Научно-исследовательского института риса Юго-Западного университета в Чунцине и Хайнане, Китай.

    Морфологический и микроскопический анализ

    mfs2

    Раннее развитие колосков у mfs2 и растений дикого типа исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа (SU3500; Hitachi) с охлаждающей площадкой -20 ° C в условиях низкого вакуума. На стадии цветения колоски от mfs2 и растений дикого типа наблюдали с помощью сканирующего электронного микроскопа (модель № SU3500; Hitachi) и стереомикроскопа (модель № SMZ1500; Nikon).

    Парафиновые срезы и гистологический анализ

    Метелки на разных стадиях развития собирали и фиксировали в FAA (50% [об. / Об.] Этанола, 0,9 м [м / об.] Ледяной уксусной кислоты и 3,7% [об. / Об.] Формальдегида) в течение 16 часов при 4 ° C. под вакуумом. Фиксированные метелки обезвоживали серией градуированного этанола, пропитывали ксилолом и заливали парафином. Тонкие срезы (толщиной 8 мм) получали с помощью микротома (RM2245; Leica), затем депарафинизировали в ксилоле и дегидратировали с помощью серии этанола.Срезы последовательно окрашивали 1% (мас. / Об.) Сафранином О (Amresco) и 1% (мас. / Об.) Быстрым зеленым (Amresco), и закрывали покровное стекло нейтральным бальзамом. Срезы наблюдались с помощью модели № Микроскоп E600 (Nikon).

    Клонирование на основе карты

    MFS2

    Мутант mfs2 был скрещен с cv Xinong 1A для получения популяций F1 и F2. 1464 растения F2, которые проявляли мутантный фенотип, были отобраны в качестве популяции для картирования.Простая последовательность повторяет маркеры из общедоступных баз данных по рису, включая Gramene (http://www.gramene.org) и Программу геномных исследований риса (https://rgp.dna.affrc.go.jp/index.html.en) были использованы для точного картирования MFS2 . Последовательности праймеров, используемых при картировании и анализе генов-кандидатов, перечислены в дополнительной таблице S1.

    Построение и преобразование векторов

    Для конструирования плазмиды комплементации был амплифицирован геномный фрагмент длиной 6732 п.о., который содержал кодирующую последовательность MFS2 , соединенную с нижележащими последовательностями длиной 2282 п.н. и нижестоящими 1037 п.н., с использованием праймеров MFS2 -com-F и MFS2, -com-F и . MFS2 -com-R.Фрагмент вставляли в бинарный вектор pCAMBIA1300 с использованием набора для бесшовного клонирования и сборки pEASY-Uni (Transgene). Рекомбинантные плазмиды трансформировали в мутант mfs2 , используя способ трансформации, опосредованный Agrobacterium tumefaciens , как описано в Xiao et al. (2009). Для создания конструкции для РНКи мы амплифицировали фрагмент кДНК MFS2 размером 161 п.н. с праймерами MFS2 RiF ( Sac I и Spe I) и MFS2RiR ( Bam, HI и Kpn I). .Полученные продукты ПЦР лигировали в вектор PTCK303. Рекомбинантные плазмиды трансформировали растения сорт Zh21 с использованием A . tumefaciens -опосредованный метод трансформации. Используемые последовательности праймеров перечислены в дополнительной таблице S1.

    Выделение РНК и анализ RT-qPCR

    Суммарную РНК из корня, стебля, листа, оболочки, метелки и побега растений дикого типа выделяли с использованием набора RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen). Комплементарную кДНК первой цепи синтезировали из 2 мкг тотальной РНК с использованием праймеров oligo (dT) 18 в 20 мкл реакционного объема с использованием набора PrimeScript Reagent Kit с gDNA Eraser (Takara).Анализ RT-qPCR выполняли с использованием набора SYBR Premix Ex Taq II (Takara) в системе определения последовательности ABI 7500 (Applied Biosystems). Было выполнено не менее трех повторов. ACTIN ( OsRac1 , LOC _ Os01g12900 ) использовали в качестве эндогенного контроля.

    Гибридизация на месте

    Свежие молодые метелки из mfs2 и растений дикого типа немедленно фиксировали в растворе FAA, затем дегидратировали, инфильтрировали, заделывали и делали срезы, как описано у Sang et al.(2012). Ген-специфический зонд MFS2 длиной 426 п.н. амплифицировали с праймерами MYBishF1 и MYBishR1 и метили с помощью набора для маркировки DIG RNA Labeling Kit (номер по каталогу SP6 / T7; Roche). Другие РНК-зонды для известных генов цветочных органов были созданы in vitro с использованием того же метода. Изображения были сняты с помощью модели No. Микроскоп E600 (Nikon). Последовательности праймеров, используемых для гибридизации in situ, перечислены в дополнительной таблице S1.

    Субклеточная локализация

    Полноразмерную кодирующую область (без терминирующего кодона) MFS2 амплифицировали с использованием праймеров OE MFS2 -F1 и OE MFS2 -R1 (дополнительная таблица S1).Фрагмент был клонирован в кассету экспрессии 35S-GFP-NO (pCAMBIA1301) с соответствующими модификациями, в результате чего был получен вектор слияния MFS2-GFP. Плазмиды pA7-GFP и MFS2-GFP трансформировали в протопласты риса. После инкубации в течение 12–16 ч при 28 ° C флуоресценцию GFP регистрировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (модель № LSM710; Zeiss).

    Последовательность белков и филогенетический анализ

    Белковые последовательности были загружены из GenBank (http: // www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), используя последовательность MFS2 в качестве запроса. Филогенетическое дерево было построено с помощью программы MEGA 5.0 (Tamura et al., 2011). Дерево было построено с использованием метода максимального правдоподобия на основе модели на основе матрицы JTT с самыми низкими оценками байесовских информационных критериев (Jones et al., 1992; Tamura et al., 2011). Статистическая поддержка топологии дерева была оценена с помощью бутстрап-анализа с 500 повторами.

    Анализ транскрипционной активности

    Транскрипционная активность полноразмерных и усеченных белков MFS2 была проанализирована в протопластах риса с использованием двойной системы анализа репортерной люциферазы.Люминометр GloMax 20-20 (Promega) использовали для измерения относительной активности люциферазы. Используемые праймеры перечислены в дополнительной таблице S1.

    Анализы Y2H

    Полноразмерную кодирующую область MFS2 , MFS2 1-192 , MFS2 193-306 и mfs2 амплифицировали и лигировали в вектор экспрессии дрожжей pGBKT7 для обнаружения аутоактивации белков MFS2 и mfs2. Конструкции pGBKT7- MFS2 и pGBKT7 (используемые в качестве холостого контроля) трансформировали отдельно в дрожжевой штамм Y2HGold.Трансформанты отбирали на синтетической среде отсева (SD) / — Trp или SD / -Ade / -His / -Trp среде. Используемые праймеры перечислены в дополнительной таблице S1.

    Полноразмерные кодирующие последовательности OsTPR1 , OsTPR2 и OsTPR3 были слиты с доменом активации транскрипции GAL4 (pGADT7), чтобы служить в качестве белков-приманок и белков-жертв соответственно. Плазмиды приманки и жертвы трансформировали в дрожжевой штамм Y2HGold. Двухгибридная система Matchmaker 3 (Clontech) использовалась для обнаружения взаимодействий.Каждое взаимодействие проверялось не менее трех раз.

    Анализы BiFC

    Для проведения анализов BiFC полноразмерную кодирующую область MFS2 и OsTPR амплифицировали с помощью специфичных для генов праймеров, а затем лигировали в векторы BiFC, включая pSCYNE (SCN, модифицированный) и pSCYCE (SCC, модифицированный). Пары рекомбинантных векторов котрансформировали в листьев Nicotiana benthamiana . Сигналы флуоресценции регистрировались под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом (модель №LSM 800; Цейсс). Используемые праймеры перечислены в дополнительной таблице S1.

    Регистрационный номер

    Данные последовательности из этой статьи можно найти в библиотеках данных GenBank / EMBL под номерами доступа: SNB (ABD24033), OsIDS1 (NM_001058244), MFS1 (AK242393), DL (AB106553), OsMADS1 (NM_001055911), OsMADS6 (FJ666318), OsTPR1 (AP014957), OsTPR2 (AK111830) и OsTPR3 (AP014959).

    Дополнительные данные

    Доступны следующие дополнительные материалы.

    ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

    Alvarez

    J

    ,

    Guli

    CL

    ,

    Yu

    X-H

    ,

    Smyth

    DR

    (

    1992

    )

    Терминальный цветок: ген A, влияющий на развитие соцветия 40 Arabidops.

    Завод J

    2

    :

    103

    116

    Bartlett

    ME

    ,

    Thompson

    B

    (

    2014

    )

    Идентичность и филлотаксис меристем в развитии соцветий

    .

    Фронтальный завод Sci

    5

    :

    508

    Blázquez

    MA

    ,

    Soowal

    LN

    ,

    Lee

    I

    ,

    Weigel

    D

    (

    1997

    )

    Экспрессия LEAFY и начало цветения у Arabidopsis

    .

    Девелопмент

    124

    :

    3835

    3844

    Брэдли

    D

    ,

    Рэтклифф

    O

    ,

    Винсент

    C

    ,

    Карпентер

    R

    ,

    Coen

    E

    (

    1997

    , архитектура Infloopis

    res.

    Наука

    275

    :

    80

    83

    Chen

    Y

    ,

    Yang

    XY

    ,

    He

    K

    ,

    Liu

    M

    ,

    Gao

    Z

    ,

    Lin

    Z 9000hang,

    Wang

    X

    (

    2006

    )

    Суперсемейство факторов транскрипции MYB Arobidopsis: анализ экспрессии и филогенетическое сравнение с семейством MYB риса

    .

    Завод Мол Биол

    60

    :

    107

    124

    Chuck

    G

    ,

    Meeley

    R

    ,

    Hake

    S

    (

    2008

    )

    Инициирование цветочной меристемы и судьба меристемных клеток регулируются генами AP2 кукурузы ids9 и sid9 и

    Девелопмент

    135

    :

    3013

    3019

    Coen

    ES

    ,

    Meyerowitz

    EM

    (

    1991

    )

    Война завитков: генетические взаимодействия, контролирующие развитие цветов

    .

    Природа

    353

    :

    31

    37

    Coen

    ES

    ,

    Nugent

    JM

    (

    1994

    )

    Эволюция цветков и соцветий

    .

    Девелопмент

    1994

    :

    107

    Dreni

    L

    ,

    Pilatone

    A

    ,

    Yun

    D

    ,

    Erreni

    S

    ,

    Pajoro

    A

    ,

    Caporali

    E

    ,

    Caporali

    Катер

    MM

    (

    2011

    )

    Функциональный анализ всех членов подсемейства AGAMOUS у риса показывает их роль в определении идентичности репродуктивного органа и детерминированности меристемы

    .

    Заводская ячейка

    23

    :

    2850

    2863

    Dubos

    C

    ,

    Stracke

    R

    ,

    Grotewold

    E

    ,

    Weisshaar

    B

    ,

    Martin

    C

    ,

    Lepiniec

    9000

    9000

    9000 факторы Arabidopsis

    .

    Trends Plant Sci

    15

    :

    573

    581

    Gonzalez

    D

    ,

    Bowen

    AJ

    ,

    Carroll

    TS

    ,

    Conlan

    RS

    (

    2007

    )

    Транскрипционный основной гистон-прессор MED14 с компонентами MED14 взаимодействует с ) и CDK8 (HEN3) для репрессии транскрипции

    .

    Mol Cell Biol

    27

    :

    5306

    5315

    Hu

    L

    ,

    Liang

    W

    ,

    Yin

    C

    ,

    Cui

    X

    ,

    Zong

    J

    ,

    Wang

    X 9000 9000

    ,

    Zhang

    D

    (

    2011

    )

    Рис MADS3 регулирует гомеостаз ROS во время позднего развития пыльника

    .

    Растительная ячейка

    23

    :

    515

    533

    Икеда

    K

    ,

    Sunohara

    H

    ,

    Nagato

    Y

    (

    2004

    )

    Ход развития соцветия и колоска в рисе

    .

    Япония J Разведение

    54

    :

    147

    156

    Ито

    Дж

    ,

    Нономура

    К

    ,

    Икеда

    К

    ,

    Ямаки

    С

    ,

    Инукай

    Й

    ,

    Ямагиши

    Nagato

    Y

    (

    2005

    )

    Развитие растений риса: от зиготы до колоска

    .

    Физиология растительных клеток

    46

    :

    23

    47

    Jeon

    JS

    ,

    Jang

    S

    ,

    Lee

    S

    ,

    Nam

    J

    ,

    Kim

    C

    ,

    Lee

    SH

    0009,

    000 Kim

    SR

    ,

    Lee

    YH

    ,

    Cho

    YG

    , и другие. (

    2000

    )

    стерильная листовая скорлупа1 представляет собой гомеотическую мутацию в гене MADS-бокса риса, влияющую на развитие цветков риса

    .

    Растительная ячейка

    12

    :

    871

    884

    Jin

    Y

    ,

    Luo

    Q

    ,

    Tong

    H

    ,

    Wang

    A

    ,

    Cheng

    Z

    ,

    Tang

    Li

    , Чжао

    X

    ,

    Li

    X

    ,

    Ван

    Дж

    , и другие. (

    2011

    )

    Ген AT-hook необходим для формирования палеи и контроля количества цветочных органов у риса

    .

    Dev Biol

    359

    :

    277

    288

    Jones

    DT

    ,

    Taylor

    WR

    ,

    Thornton

    JM

    (

    1992

    )

    Быстрое создание матриц данных мутаций из последовательностей белков

    .

    Comput Appl Biosci

    8

    :

    275

    282

    Канеко

    M

    ,

    Inukai

    Y

    ,

    Ueguchi-Tanaka

    M

    ,

    Itoh

    H

    ,

    Izawa

    T

    ,

    9000 9000 9000 9000i Kobayash ,

    Miyao

    A

    ,

    Hirochika

    H

    ,

    Ashikari

    M

    , и другие.(

    2004

    )

    Мутации потери функции в гене риса GAMYB нарушают экспрессию α-амилазы в алейроне и развитие цветков

    .

    Растительная ячейка

    16

    :

    33

    44

    Kellogg

    EA

    (

    2001

    )

    История эволюции трав

    .

    Plant Physiol

    125

    :

    1198

    1205

    Khanday

    I

    ,

    Yadav

    SR

    ,

    Vijayraghavan

    U

    (

    2013

    )

    Rice LHS1 / OsMADS1 контролирует спецификацию меристемы цветков путем скоординированной регуляции факторов пути транскрипции

    сигналов гормона и гормональной регуляции.

    Plant Physiol

    161

    :

    1970

    1983

    Кобаяши

    К

    ,

    Маэкава

    M

    ,

    Мияо

    A

    ,

    Хирочика

    H

    ,

    Киозука

    J

    (

    000) 2010
    PANICLE PHYTOMER2 ( PAP2 ), кодирующий белок MADS-бокс подсемейства SEPALLATA, положительно контролирует идентичность меристемы колосков у риса

    .

    Физиология растительных клеток

    51

    :

    47

    57

    Krogan

    NT

    ,

    Long

    JA

    (

    2009

    )

    Почему так репрессируют? Отключение транскрипции при росте и развитии растений

    .

    Curr Opin Plant Biol

    12

    :

    628

    636

    Lee

    DY

    ,

    An

    G

    (

    2012

    )

    Два гена семейства AP2, сверхкомплектный прицветник ( SNB ) и Osindeterminate колоск 1 ( OsIDS1 архитектура контролирует соцветие), синергетический контроль соцветия и установление цветочной меристемы в рисе

    .

    Завод J

    69

    :

    445

    461

    Lee

    DY

    ,

    Lee

    J

    ,

    Moon

    S

    ,

    Park

    SY

    SY

    ,

    An

    G

    (

    2007

    )

    Гетерохронный ген RISS ER переход от меристемы колосков к меристеме цветков

    .

    Завод J

    49

    :

    64

    78

    Li

    H

    ,

    Liang

    W

    ,

    Jia

    R

    ,

    Yin

    C

    ,

    Zong

    J

    ,

    Kong

    H

    000 D

    ,

    2010

    )

    AGL6-подобный ген OsMADS6 регулирует идентичность цветочных органов и меристем у риса

    .

    Cell Res

    20

    :

    299

    313

    Li

    X

    ,

    Sun

    L

    ,

    Tan

    L

    ,

    Liu

    F

    ,

    Zhu

    Z

    ,

    Fu

    Y

    000

    ,

    Sun Солнце

    X

    ,

    Xie

    D

    ,

    Солнце

    C

    (

    2012

    )

    Th2 , ген, подобный домену DUF640, контролирует развитие леммы и палеа у риса

    .

    Завод Мол Биол

    78

    :

    351

    359

    Liu

    Z

    ,

    Karmarkar

    V

    (

    2008

    )

    Корепрессоры семейства Groucho / Tup1 в развитии растений

    .

    Trends Plant Sci

    13

    :

    137

    144

    Long

    JA

    ,

    Ohno

    C

    ,

    Smith

    ZR

    ,

    Meyerowitz

    EM

    (

    2006

    )

    TOPLESS регулирует судьбу апикального эмбриона

    у Arabidopsis.

    Наука

    312

    :

    1520

    1523

    Long

    JA

    ,

    Woody

    S

    ,

    Poethig

    S

    ,

    Meyerowitz

    EM

    ,

    Barton

    MK

    (

    превращается в

    2002

    мутантных побегов) в локусе TOPLESS

    .

    Девелопмент

    129

    :

    2797

    2806

    Луо

    Q

    ,

    Чжоу

    K

    ,

    Zhao

    X

    ,

    Zeng

    Q

    ,

    Xia

    H

    ,

    Zhai

    W

    ,

    Zhai

    W

    ,

    Wu

    X

    ,

    Yang

    H

    ,

    Zhu

    L

    (

    2005

    )

    Идентификация и точное картирование мутантного гена бледного колоска риса

    .

    Планта

    221

    :

    222

    230

    Malcomber

    ST

    ,

    Kellogg

    EA

    (

    2004

    )

    Гетерогенные паттерны экспрессии и отдельные роли гена SEPALLATA LEAFY HULL STERILE1 в травах

    .

    Заводская ячейка

    16

    :

    1692

    1706

    McSteen

    P

    ,

    Laudencia-Chingcuanco

    D

    ,

    Colasanti

    J

    (

    2000

    )

    Цветочек под любым другим названием: Контроль идентичности меристемы кукурузы

    .

    Trends Plant Sci

    5

    :

    61

    66

    Mimida

    N

    ,

    Goto

    K

    ,

    Kobayashi

    Y

    ,

    Araki

    T

    ,

    Ahn

    JH

    ,

    000 D

    000

    000 9000 9000 9000 9000

    Weigel 9000 9000

    Motoyoshi

    F

    ,

    Sakamoto

    W

    (

    2001

    )

    Функциональная дивергенция семейства TFL1-подобных генов у Arabidopsis, выявленная при характеристике нового гомолога

    .

    Гены Клетки

    6

    :

    327

    336

    Nagasawa

    N

    ,

    Miyoshi

    M

    ,

    Sano

    Y

    ,

    Satoh

    H

    ,

    Hirano

    H

    ,

    Yakai

    000

    000

    Sakai

    2003

    )

    SUPERWOMAN1 Гены и DROOPING LEAF контролируют идентичность цветочных органов у риса

    .

    Девелопмент

    130

    :

    705

    718

    Nakagawa

    M

    ,

    Shimamoto

    K

    ,

    Kyozuka

    J

    (

    2002

    )

    Сверхэкспрессия RCN1 и RCN2, изменение фазового перехода рисового TERMINAL FLOWER 1 / гомологи с измененной морфологией CENTRORADIS в рисе

    .

    Завод J

    29

    :

    743

    750

    Омори

    S

    ,

    Кимизу

    M

    ,

    Sugita

    M

    ,

    Miyao

    A

    ,

    Hirochika

    H

    ,

    0003000

    00030003 Uchida

    Uchida

    Йошида

    H

    (

    2009

    )

    MOSAIC FLORAL ORGANS1 , AGL6-подобный ген MADS box, регулирует идентичность цветочных органов и судьбу меристемы у риса

    .

    Растительная ячейка

    21

    :

    3008

    3025

    Ó’Maoiléidigh

    DS

    ,

    Graciet

    E

    ,

    Wellmer

    F

    (

    2014

    )

    Генные сети, контролирующие развитие цветка Arabidopsis thaliana

    .

    Новый Фитол

    201

    :

    16

    30

    Prasad

    K

    ,

    Parameswaran

    S

    ,

    Vijayraghavan

    U

    (

    2005

    )

    OsMADS1 , фактор MADS-бокса риса, контролирует дифференцировку определенных типов клеток в lemma и palea и является регулятором раннего действия внутренних органов цветков

    .

    Завод J

    43

    :

    915

    928

    Prasad

    K

    ,

    Sriram

    P

    ,

    Kumar

    CS

    ,

    Kushalappa

    K

    ,

    Vijayraghavan

    U

    M

    роль в указании lemma и palea, цветочных органов травы, аналогичных чашелистикам

    .

    Dev Genes Evol

    211

    :

    281

    290

    Prusinkiewicz

    P

    ,

    Erasmus

    Y

    ,

    Lane

    B

    ,

    Harder

    LD

    ,

    Coen

    E

    (

    2007 9resolution и

    2007 9resolution.

    Наука

    316

    :

    1452

    1456

    Rao

    NN

    ,

    Prasad

    K

    ,

    Kumar

    PR

    ,

    Vijayraghavan

    U

    (

    2008

    )

    Четкое регулирование времени и роль регламента для RFL, определения цветения и определения риса. Завод Архитектура

    .

    Proc Natl Acad Sci USA

    105

    :

    3646

    Ratcliffe

    OJ

    ,

    Bradley

    DJ

    ,

    Coen

    ES

    (

    1999

    )

    Разделение побегов и цветков у Arabidopsis

    .

    Девелопмент

    126

    :

    1109

    1120

    Ren

    D

    ,

    Cui

    Y

    ,

    Hu

    H

    ,

    Xu

    Q

    ,

    Rao

    Y

    ,

    Yu

    X Z

    , 9000

    ,

    Ван

    Y

    ,

    Peng

    Y

    ,

    Zeng

    D

    , и другие. (

    2019

    )

    Ah3 кодирует белок домена MYB, который определяет судьбу шелухи и влияет на урожайность и качество зерна риса

    .

    Завод J

    100

    :

    813

    824

    Ren

    D

    ,

    Li

    Y

    ,

    Zhao

    F

    ,

    Sang

    X

    ,

    Shi

    J

    ,

    Wang

    N

    N

    ,

    Лин

    Y

    ,

    Zhang

    C

    ,

    Ян

    Z

    , и другие. (

    2013

    )

    MULTI FLORET SPIKELET1 , который кодирует белок AP2 / ERF, определяет судьбу меристемы колосков и идентичность стерильной леммы у риса

    .

    Plant Physiol

    162

    :

    872

    884

    Sang

    X

    ,

    Li

    Y

    ,

    Luo

    Z

    ,

    Ren

    D

    ,

    Fang

    L

    ,

    Wang

    N

    000

    N

    ,

    Лин

    Y

    ,

    Ян

    Z

    ,

    Лю

    Y

    , и другие. (

    2012

    )

    CHIMERIC FLORAL ORGANS1 , кодирующий белок MADS-бокса, специфичный для однодольных растений, регулирует идентичность цветочных органов у риса

    .

    Plant Physiol

    160

    :

    788

    807

    Sussex

    IM

    ,

    Kerk

    NM

    (

    2001

    )

    Развитие архитектуры предприятия

    .

    Curr Opin Plant Biol

    4

    :

    33

    37

    Tamura

    K

    ,

    Peterson

    D

    ,

    Peterson

    N

    ,

    Stecher

    G

    ,

    Nei

    M

    ,

    Kumar

    S9000

    S

    2011 Молекулярно-эволюционный генетический анализ с использованием методов максимального правдоподобия, эволюционной дистанции и максимальной экономии

    .

    Mol Biol Evol

    28

    :

    2731

    2739

    Wang

    K

    ,

    Tang

    D

    ,

    Hong

    L

    ,

    Xu

    W

    ,

    Huang

    J

    ,

    Li

    M 9000

    ,

    Сюэ

    Y

    ,

    Cheng

    Z

    (

    2010

    )

    DEP и AFO регулируют репродуктивную функцию риса

    .

    PLoS Genet

    6

    :

    e1000818

    Сяо

    H

    ,

    Tang

    J

    ,

    Li

    Y

    ,

    Wang

    W

    ,

    Li

    X

    ,

    Jin

    L

    000

    000

    Ло

    H

    ,

    Zhao

    X

    ,

    Meng

    Z

    , и другие. (

    2009

    )

    STAMENLESS 1 , кодирующий единственный белок цинкового пальца C2h3, регулирует идентичность органов цветка у риса

    .

    Завод J

    59

    :

    789

    801

    Yamaguchi

    T

    ,

    Lee

    DY

    ,

    Miyao

    A

    ,

    Hirochika

    H

    ,

    An

    G

    ,

    Hirano 9000 9000

    Функция двух генов MADS-бокса C-класса OSMADS3 и OSMADS58 в Oryza sativa

    .

    Растительная ячейка

    18

    :

    15

    28

    ян He

    Z

    (

    2015

    )

    Curved chimeric palea 1, кодирующий EMF1-подобный белок, поддерживает эпигенетическую репрессию OsMADS58 в развитии рисовой Palea

    .

    Завод J

    82

    :

    12

    24

    Yao

    SG

    ,

    Ohmori

    S

    ,

    Kimizu

    M

    ,

    Yoshida

    H

    (

    2008

    )

    Неравномерная генетическая избыточность OsADM404 0402 0402 OsADM и OsADM4S PISTI4 , в развитии лодикул и тычинок

    .

    Физиология растительных клеток

    49

    :

    853

    857

    Yoshida

    A

    ,

    Ohmori

    Y

    ,

    Kitano

    H

    ,

    Taguchi-Shiobara

    F

    ,

    Hirano

    H-Y

    (

    )
    Аберрантный колоск и метелка1 , кодирующие родственный TOPLESS транскрипционный ко-репрессор, участвуют в регуляции судьбы меристемы у риса

    .

    Завод J

    70

    :

    327

    339

    юаней

    Z

    ,

    Gao

    S

    ,

    Xue

    DW

    ,

    Luo

    D

    ,

    Li

    LT

    ,

    Ding

    9000

    SY

    X

    ,

    Wilson

    ZA

    ,

    Qian

    Q

    ,

    Zhang

    DB

    (

    2009

    )

    RETARDED PALEA1 контролирует развитие палеа и цветочную зигоморфию у риса

    .

    Plant Physiol

    149

    :

    235

    244

    Zahn

    LM

    ,

    Kong

    H

    ,

    Leebens-Mack

    JH

    ,

    Kim

    S

    ,

    Soltis

    PS

    ,

    DE 9000 9000 LL

    Solt9 ,

    Depamphilis

    CW

    ,

    Ma

    H

    (

    2005

    )

    Эволюция подсемейства SEPALLATA генов MADS-бокса: происхождение из преангиосеменных с множественными дупликациями на протяжении истории покрытосеменных

    .

    Генетика

    169

    :

    2209

    2223

    Zhang

    G-H

    ,

    Xu

    Q

    ,

    Zhu

    X-D

    ,

    Qian

    Q

    ,

    Xue

    H-W

    (

    2009

    )
    SHALLOT LIKE1 представляет собой фактор транскрипции KANADI, который модулирует скручивание рисового листа, регулируя развитие абаксиальных клеток листа

    .

    Растительная ячейка

    21

    :

    719

    735

    Чжан

    H

    ,

    Liang

    W

    ,

    Ян

    X

    ,

    Luo

    X

    ,

    Jiang

    N

    ,

    Ma

    H

    , D

    2010

    )

    Пыльник с недостатком углерода кодирует белок домена MYB, который регулирует разделение сахара, необходимое для развития рисовой пыльцы

    .

    Plant Cell

    22

    :

    672

    689

    Zheng

    M

    ,

    Wang

    Y

    ,

    Wang

    Y

    ,

    Wang

    C

    ,

    Ren

    Y

    ,

    Lv

    9000

    J

    ,

    Wu

    T

    ,

    Liu

    K

    ,

    Zhao

    S

    , и другие. (

    2015

    )

    ДЕФОРМИРОВАННЫЙ ЦВЕТОЧНЫЙ ОРГАН1 ( DFO1 ) регулирует идентичность цветочного органа путем эпигенетического подавления экспрессии OsMADS58 в рисе ( Oryza sativa )

    .

    Новый Фитол

    206

    :

    1476

    1490

    Zhu

    QH

    ,

    Ramm

    K

    ,

    Shivakkumar

    R

    ,

    Dennis

    ES

    ,

    Upadhyaya

    9CE0003 NM

    THER (

    EN), одиночный Белок домена MYB участвует в развитии пыльников у риса

    .

    Plant Physiol

    135

    :

    1514

    1525

    Zhu

    X

    ,

    Liang

    W

    ,

    Cui

    X

    ,

    Chen

    M

    ,

    Yin

    C

    ,

    Luo

    Z

    ,

    Z Lucas

    WJ

    ,

    Wang

    Z

    ,

    Zhang

    D

    (

    2015

    )

    Брассиностероиды способствуют развитию зерен и семян рисовой пыльцы, вызывая экспрессию Carbon Starved Anther, белка домена MYB

    .

    Завод J

    82

    :

    570

    581

    Zhuang

    H

    ,

    Wang

    HL

    ,

    Zhang

    T

    ,

    Zeng

    XQ

    ,

    Chen

    H

    ,

    Wang

    9000

    J Чжэн

    H

    ,

    Tang

    J

    ,

    Ling

    YH

    , и другие. (

    2020

    )

    NONSTOP GLUMES1 кодирует белок цинкового пальца C2h3, который регулирует развитие колосков у риса

    .

    Plant Cell

    32

    :

    392

    413

    Заметки автора

    © 2020 Американское общество биологов растений. Все права защищены.

    © Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press от имени Американского общества биологов растений. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая разрешает неограниченное повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа правильно процитировано.

    определение, этимология и использование, примеры и родственные слова

    Требуется немного терпения, чтобы подвести тарантула, укусившего коварный колосок, к входу в нору.

    «Жизнь паука» Ж. Анри Фабра

    Он заполнен крошечными колосками или маленькими волосатыми спинакеями, очень похожими на те, что встречаются у спелых собачьих коней в домашних условиях.

    Джеймс Инглис «Спорт и работа на непальских рубежах»

    Мы видим, что цветок состоит из нескольких маленьких колосков; на нашем стволе восемнадцать.

    «Полевые цветы на ферме» Артура Оуэнса Кука

    Тщательно обрезаем завитки и колоски.

    «Охотники за скальпом» Мэйн Рид

    Об увеличении количества цветков в колосках некоторых трав уже упоминалось (с. 351).

    «Овощная тератология» Максвелла Т. Мастерс

    Колоски двустворчатые, один сидячий и один на цветоножках; колоски на цветоножках не похожи на сидячие, и оба они обычно двухцветковые.

    «Справочник некоторых южно-индийских трав» Рай Бахадур К. Ранга Ачарияр

    Таким образом, ухо намного уже, а колоски выступают более горизонтально, чем у наших нынешних форм.